基金项目：国家重点研发计划(2017YFC1600500)
第一作者简介：刘小红，硕士，主管技师，主要研究方向：理化检验与食品安全通信作者：罗苹，硕士，副主任技师,Email:2111131@qq ㊃论㊀著㊃
武汉市不同种类茶叶中9,10-蒽醌污染
水平及膳食暴露
刘小红，李永刚，孔芳，聂晓明，唐琳，闻胜，罗苹
应用毒理湖北省重点实验室湖北省疾病预防控制中心，武汉㊀430079
摘要：目的㊀了解武汉市售茶叶中9,10-蒽醌的污染水平，并对通过茶水摄入的9,10-蒽醌进行膳食暴露评估㊂方法㊀用气相谱-串联质谱法对武汉市茶叶市场销售的36份茶叶中的9,10-蒽醌含量进行检测㊂结果㊀36份茶叶样品中均不同程度检出9,10-蒽醌，浓度范围为0.0080mg/kg~0.137mg/kg，我们国家尚未设定9,10-蒽醌的限值，参考欧盟的标准，总体超标率为86.11%(31/36)㊂发酵程度越高的茶叶中残留的9,10-蒽醌也越高：其中全/后发酵茶中9,10-蒽醌浓度均值最高为0.0762mg/kg，超标率为100%；其次为轻/半发酵茶，浓度均值为
0.0452mg/kg，超标率为86.7%；不发酵茶，浓度均值为0.0262mg/kg，超标率为42.9%㊂根据人们的饮茶习惯，我们以1ʒ50的茶水比用沸水冲泡茶叶5分钟后，检测茶汤中9,10-蒽醌浓度为0.0004mg/kg~0.01mg/kg，平均浸出率为7.2%㊂根据膳食暴露风险评估公式计算，茶叶中9,10-蒽醌成人的日均暴露量为0.0551μg/kg bw/day㊂结论㊀武汉市售茶叶中存在一定程度的9,10-蒽醌污染，且超标率较高㊂由于未制定9,10-蒽醌的每日容许摄入量(ADI)，因此无法评估通过茶叶摄入的9,10-蒽醌对健康造成的风险㊂
关键词：茶叶;9,10-蒽醌；风险评估
中图分类号:R181㊀文献标识码:A㊀文章编号:1006-2483(2021)03-0045-05㊀DOI:10.3969/j.issn.1006-2483.2021.03.011 Study on the contamination level and dietary exposure of
9,10-anthraquinone in different types of teas in Wuhan
LIU Xiaohong,LI Yonggang,KONG Fang,NIE Xiaoming,TANG Lin,WEN Sheng,LUO Ping Hubei Provincial Key Laboratory for Applied Toxicology,Hubei Provincial Centre for Disease Control and Prevention,
Wuhan㊀430079,China
Corresponding author:LUO Ping,Email:2111131@qq
Abstract:㊀Objective㊀To investigate the pollution level of9,10-anthraquinone in teas sold in Wuhan,and to assess the dietary exposure of9,10-anthraquinone ingested through tea.㊀Methods㊀The content of9,10-anthraquinone in teas collected from local tea markets in Wuhan was analyzed by GC-MS/MS.㊀Results㊀9,10-anthraquinone was detected in all36tea samples with a concentration ranging from0.0080mg/kg to0.137mg/kg.The standard limit for9,10-anthraquinone has not yet been set in China.Referring to EU standards,the total over-standard rate was86.11%(31/36). Generally,the concentration of residual9,10-anthraquinone was higher in highly fermented teas.The highest average concentration of residual9,10-anthraquinone was found in fully/post-fermented tea(0.0762mg/kg),and the over-standard rate was100%.The second highest was in semi-fermented tea(0.0452mg/kg),and the over-standard rate was 86.7%.The concentration of9,10-anthraquinone in non-fermented tea was0.0262mg/kg,and the over-standard rate was 42.9%.According to people s tea-drinking habits,tea samples were brewed with boiling water(1ʒ50)for5minutes,and the concentration of9,10-anthraquinone in tea souPwas0.0004mg/kg~0.01mg/kg,with an average leaching rate of7.2%. The average daily intake exposure of tea for an adult was0.0551μg/kg bw/day.㊀Conclusion㊀There was a certain degree of9,10-anthraquinone pollution in the teas sold in Wuhan,and the rate exceeding the sta
ndard was high.Since the acceptable daily intake(ADI)for9,10-anthraquinone has not been established,it is impossible to assess the health risks of 9,10-anthraquinone ingested through tea.
Keywords:Tea;9,10-anthruinone;Risk assessment
㊀㊀茶叶由于富含茶多酚㊁㊁氨基酸㊁多糖[1-2]等多种对人体健康有益的有机化合物，一直深受消费者青睐，世界上多达160多个国家有饮茶的习惯㊂然而随着茶叶种植环境的不断恶化，许多污染物如重金属㊁农药㊁有机污染物等均可以通过土壤㊁水㊁大气富集在茶叶中[3-4]㊂近些年来，我国出口茶叶多次因9,10-蒽醌检出问题受到欧盟通报[5],9,10-蒽醌作为一种新型茶叶污染物开始逐渐受到人们关注㊂
9,10-蒽醌(Anthruinone,AQ)是一种淡黄的单斜针状晶体，溶于乙醇㊁乙醚和丙酮，不溶于水[6]㊂它是除偶氮染料外应用最广的染料，许多造纸厂还将9,10-蒽醌用作造纸工艺的添加剂，同时它还作驱鸟剂使用㊂根据文献报道[7-10],9,10-蒽醌在空气㊁水㊁土壤植物㊁鱼类㊁海产品和动物组织里均有检出，可在自然环境中普遍存在㊂由于9,10 -蒽醌存在潜在的致癌风险,EFSA(European Food Safety Authority)[6]规定茶叶中9,10-蒽醌的最大残留限量MRL为0.02mg/kg，其他国家暂未制定9,10-蒽醌在茶叶中的限量标准㊂
目前关于茶叶中蒽醌的膳食暴露研究多是基于茶叶中蒽醌含量来进行评估，然而人们的饮茶习惯是饮用
茶汤(浸出液)，因此通过茶叶摄入9,10-蒽醌的膳食暴露风险取决于茶汤中9,10-蒽醌的含量㊂湖北省茶资源丰富，湖北人喜爱喝茶，且对于不同发酵程度的茶叶饮茶习惯也不一样，因此膳食暴露风险也有差异㊂按照发酵程度不同，茶叶可分为不发酵茶，轻/半发酵茶，全发酵/后发酵茶[3,11]，每一类茶叶尽可能采集市场上流通性强有代表性的品种检测其9,10-蒽醌污染水平，并将茶叶用沸水冲泡后，考察了茶汤中9,10-蒽醌的浓度水平及其浸出率㊂根据茶汤中9,10-蒽醌的浓度均值并结合湖北省茶叶膳食消费量调查数据评估了武汉市居民通过茶叶摄入9,10-蒽醌的暴露风险㊂这些数据为今后我国茶叶中9,10-蒽醌相关限量标准的制定提供数据支撑，并为评估饮茶与健康的关系提供参考㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀样品㊀每份茶叶采集500g，共采集到36个茶样，采集到的茶叶信息(表1)㊂在采集样品过程中，对样品实施全过程控制，避免带入外源性化学物㊂干茶样品要先经粉碎机粉碎后过40目筛，于常温避光保存㊂
茶叶浸泡：取3g茶叶样品于玻璃容器中，用150mL煮沸的超纯水(茶水比为1ʒ50)冲泡5min 后滤去茶水，收集茶渣于60ħ烘箱烘烤1h㊂冲泡过程中，对样品实施全过程控制，避免带入外源性化学物㊂分别测定冲泡前的干燥茶叶与冲泡后烘干的茶渣中9,10-蒽醌的含量，二者差值即为茶汤中9,10-蒽醌的含量㊂
表1㊀茶叶样品信息表
Table1㊀The detailed information of tea samples
茶叶类型数量茶叶种类品牌
不发酵茶7绿茶绿茶㊁碧螺春㊁毛尖
轻/半发酵茶15
白茶，黄茶,
乌龙茶
白茶，黄芽，白牡丹，乌龙茶,
大红袍，铁观音
全发酵茶4红茶红茶，金骏眉，正山小种
后发酵茶10黑茶，普洱茶普洱，砖茶
1.2㊀茶叶中9,10-蒽醌的测定㊀检测方法：依据国家卫生和计划生育委员会发布的‘2017年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册“[6]中茶叶中蒽醌测定的标准操作程序进行操作㊂
1.2.1㊀仪器与试剂㊀气相谱串联三重四级杆质谱7890B/7000C(美国Agilent公司),DB-5MS(30 mˑ0.25mmˑ0.25μm)，乙酸乙酯(谱纯)，乙腈(谱纯),QuECHERS净化包(含0.8g无水硫酸钠,0.8g PSA粉末和0.4g C18固相吸附剂，迪马科技)㊂9,10-蒽醌标准储备液(100μg/mL，纯度99.9%，德国Dr.Ehrenstorfer)㊂蒽醌-d8标准品(纯度98.6%，加拿大C/D/N ISOTOPES)㊂
1.2.2㊀标准曲线㊀取9,10-蒽醌标准储备液10μL，用环己烷-乙酸乙酯定容至1mL，配制成浓度为1μg/mL的9,10-蒽醌标准应用液㊂避光冷藏㊂称取蒽醌-d8内标0.01000g，加丙酮超声㊁溶解㊁稀释定容至10mL配制成浓度为0.986mg/mL的蒽醌-d8内标中间液；取蒽醌-d8内标中间液100μL，用环己烷-乙酸乙酯定容至1mL，最终配制成浓度为98.6μg/mL蒽醌-d8内标应用液㊂分别取9,10-蒽醌标准应用液0㊁10㊁20㊁50㊁100㊁150㊁200μL，加入内标应用液各10μL，用乙腈定容至1mL，配制成浓度为0㊁10㊁20㊁50㊁100㊁150㊁200μg/mL的标准系列，蒽醌-d8的浓度为0.986μg/mL㊂
1.2.3㊀茶叶样品前处理㊀提取：称取2g(准确至0.001g)样品于50mL具塞离心管中，加内标20μL，加水3mL，涡旋润湿样品，加10mL乙腈，超声㊁振荡提取30min，加无水硫酸钠2g，涡旋1min,8000 rpm下离心10min，待净化㊂
净化：取乙腈提取液约8mL，加入0.8g无水硫酸钠,0.8g PSA粉末和0.4g C18固相吸附剂，涡旋1min,8000rpm离心5min㊂取上清液5.0mL,40ʎ
C氮吹浓缩至近干，加1.0mL乙腈溶解残渣,8000 rpm离心5min，上清液过0.45μm PTFE膜，待测定㊂
1.2.4㊀仪器条件㊀MRM模式,DB-5MS柱(30m ˑ0.25mm,0.25μm)，柱温:80ħ(1min),15ħ/ min到240ħ(2min)，再以40ħ/min到280ħ(5 min)；进样口和传输线温度分别为230ħ和280ħ㊂载气为He，不分流进样，进样量:1μL，溶剂延迟4 min；离子源和四极杆温度分别为230ħ和150ħ，质谱条件(表2)㊂
1.2.5㊀定性及定量分析㊀定性：进行样品测定时，以保留时间及离子比率定性，各个离子对均应出现且其丰度比与标准的离子丰度比相一致(定性离子相对丰度的最大允许偏差)(表3)㊂
表2㊀标准品及内标相关质谱参数
Table2㊀Mass spectrometry parameters of standard
and internal standard
化合物保留时间
(min)离子对Dwell(s)Coll(eV)Delay(s)
蒽醌9.24208>180∗0.06100.02
208>152㊀0.06100.02蒽醌-d89.21216>188㊀0.06100.02㊀㊀注:∗为定量离子㊂
表3㊀定性离子相对丰度的最大允许偏差
Table3㊀Maximum allowable deviation of relative
abundance of qualitative ions
相对离子丰度>50%>20%~50%>10%~20%ɤ10%允许的相对偏差ʃ20%ʃ25%ʃ30%ʃ50%㊀㊀定量：以系列标准溶液中目标化合物的浓度为横坐标，以定量离子对(208>180)的峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线，用峰面积内标法定量得到试样提取液中被测组分的含量㊂1.3㊀暴露评估㊀长期膳食摄入评估：按照FAO/ WHO(联合国粮农组织/世界卫生组织)推荐的‘食品化学物膳食暴露评估“中的确定性评估(点评估)法[12-13]，结合所测得的茶汤中9,10-蒽醌的含量和茶叶消费量数据计算茶叶中9,10-蒽醌膳食暴露风险㊂
计算公式：茶叶中9,10-蒽醌的日均暴露量(μg/kg bw/day)=茶汤中9,10-蒽醌平均含量(μg/kg)ˑ茶叶的人均日消费量(g)/平均体重(kg)
按照‘第五次中国总膳食研究“[14]的数据，湖北省标准人日均茶水膳食消费量为85.19g/d，折算成茶叶为1.022g/d，成人体重按照63kg标准化进行计算㊂
1.4㊀数据处理㊀为了评估不同类型茶叶和茶浸出液中蒽醌含量的差异，使用统计软件IBM SPSS Statistics V2
2.0软件进行数据分析㊂采用Shapiro-Wilk法(样本量n<50)检验样本是否呈正态分布㊂采用独立样本t检验(正态分布)或Mann Whitney 秩和检验(偏态分布)比较两组数据间是否具有显著性差异,P<0.05组间两两比较差异具有统计学意义[15-16]㊂
2㊀结㊀果
2.1㊀茶叶中9,10-蒽醌检测结果㊀36份不同种类的茶叶样品中均有9,10-蒽醌检出，浓度范围为0.008mg/kg~0.1375mg/kg㊂根据欧盟EUNo 1146/2014的规定，茶叶中9,10-蒽醌的最大残留限量为0.02mg/kg,36份样品中有32份超标，超标率最高的是全/后发酵茶(100%)㊁其次为轻/半发酵茶(86.70%)㊁不发酵茶(42.90%)㊂
表4㊀茶叶样品中9,10-蒽醌含量情况
Table4㊀9,10-anthraquinone concentration in tea samples
茶叶种类样品量超标率(%)浓度范围(mg/kg)均值(mg/kg)中位值(mg/kg)不发酵茶742.900.008~0.06850.02620.0219
轻/半发酵茶1586.700.016~0.09040.04520.0368
全/后发酵茶14100.000.028~0.13750.07620.0728
合计3686.110.008~0.13750.05350.0503
㊀㊀为了更直观的对不同类型茶叶中9,10-蒽醌残留量进行比较，使用GraphPad Prism5软件，结合每一类茶叶9,10-蒽醌含量的最小值，第一四分位数，中位数，第三四分位数和最大值5个统计量绘制了箱叶图(图1)㊂可以看出不同种类茶叶中9,10 -蒽醌含量不同，轻/半发酵茶中残留的9,10-蒽醌的盒子和胡须的长度比其他类型茶长，这表明轻/半发酵茶中残留的9,10-蒽醌的变化范围更大
(0.016~0.0904mg/kg)㊂全/后发酵茶的9,10-蒽醌浓度均值和中位数最高，分别为0.0762mg/kg 和0.0728mg/kg；其次是轻/半发酵茶，分别为0.452mg/kg和0.0368mg/kg；不发酵茶中的9,10
-蒽醌浓度均值和中位数最低，分别为0.0262mg/ kg和0.0219mg/kg㊂以上结果表明，随着发酵程度的增加，茶叶中残留的9,10-蒽醌逐渐增加，且全/后发酵茶叶样品中的9,10-蒽醌残留量显著高于轻/半发酵茶和不发酵茶(Mann Whitney秩和检验：不发酵茶VS全/后发酵茶,P=0.001<0.05；轻/半发酵茶VS全/后发
酵茶,P=0.047<0.05)㊂
2.2㊀茶汤中9,10-蒽醌检测结果㊀考虑到人们的饮茶习惯一般是用水冲泡茶叶后饮用茶汤(浸出液)，因此本研究将茶叶用100ħ超纯水冲泡5min 后，考察了茶汤中9,10-蒽醌的浓度水平及其浸出率(表5)㊂茶汤中9,10-蒽醌浓度范围为(0.0004~0.010)mg/kg，其中全/后发酵茶汤中浸出的9,10-蒽醌变化范围最大(0.001~0.010 mg/kg)，茶汤中浓度均值也最高(0.0053mg/kg)㊂随着发酵程度降低，茶汤中浓度均值也逐渐下降，轻/半发酵茶和不发酵茶的茶汤中9,10-蒽醌均值分别为0.0027mg/kg和0.0014mg/kg㊂本研究发现茶汤中9,10-蒽醌的浸出结果与茶叶中的9,10-蒽醌残留量呈正相关，同样的结果也被Xuan Wang等[17]证实㊂由2.1结论可知，随着发酵程度的增加，干茶中9,10-蒽醌浓度也逐渐增加，对应其茶汤中9,10-蒽醌浓度也随着发酵程度逐渐增加
㊂
图1㊀不同发酵程度茶叶中9,10-蒽醌残留箱叶图Figure1㊀Box-whisker plots of9,10-anthraquinone residues in tea with different fermentation levels
表5㊀茶汤中9,10-蒽醌浓度及其浸出率
Table5㊀The concentration of9,10-anthraquinone in tea brew and its leaching rate
茶叶种类
浓度(mg/kg)浸出率(%)
范围均值范围均值
不发酵茶0.0004~0.0040.00140.7~18.2  6.9轻/半发酵茶0.001~0.0070.0027  1.5~18.67.5全/后发酵茶0.001~0.0100.0053  1.4~13.67.0合计0.0004~0.0100.00340.7~18.67.2
2.3㊀暴露评估结果㊀根据茶汤中9,10-蒽醌含量，结合‘第五次中国总膳食研究“中湖北省标准人均茶水膳食消费量85.19g/d(折算成茶叶为1.022
g/d)，计算得出武汉市成人平均每日通过茶汤摄入9,10-蒽醌的量为(5.51ˑ10-5)μg/kg bw/day(其中不发酵
茶日均暴露量为(2.27ˑ10-5)μg/kg bw/ day，轻/半发酵茶为(4.38ˑ10-5)μg/kg bw/day，全/后发酵茶为(8.60ˑ10-5)μg/kg bw/day)，每周暴露量为(3.86ˑ10-4)μg/kg bw，低于2019年杭州市居民茶叶中9,10-蒽醌的每周平均暴露量(1.6ˑ10-3)μg/kg BW[18]㊂由于缺少食品中9,10-蒽醌的每日容许摄入量(ADI)或暂定每周耐受摄入量(PTWI)标准，因此无法评估茶叶中9,10-蒽醌的膳食暴露风险㊂
3㊀讨㊀论
研究结果显示武汉市售茶叶中9,10-蒽醌的污染较为普遍，对比欧盟标准，超标率为86.11%，且随着发酵程度的增加，茶叶中残留的9,10-蒽醌
逐渐增加㊂茶叶中9,10-蒽醌的污染可能来源于
环境中的蒽醌沉降，纸质包装材料中蒽醌的迁移或
是土壤㊁水体污染[19]㊂Xuan Wang等[17]研究发现在茶叶加工过程中，干燥过程对蒽醌损失的贡献最
大㊂由于茶叶的发酵过程是在自然环境下，把茶叶
经揉捻后堆放成一定厚度置于发酵框中，再用湿布
盖住来完成自然发酵[20]㊂因此发酵程度越大湿度也就越大，蒽醌在加工过程也就越不易降解，这就导致了茶叶的发酵程度与茶叶中蒽醌浓度水平呈正相关的结果㊂何华丽等[18]检测了杭州市售53份不同种类的茶叶样品中9,10-蒽醌含量，浓度范围为0.0050mg/kg~0.060mg/kg，有16份超标㊂所采集的4种茶叶中，黑茶中9,10~蒽醌的平均含量最高，其次是红茶，绿茶和乌龙茶中9,10-蒽醌的平均含量相差不大㊂陈涛等[21]用气相谱-串联质谱法检测福建省2017 2018年270份市售茶叶中9,10-蒽醌含量，检出率为47.4%(128/270)，浓
度范围为0.003~0.226mg/kg，平均含量0.021 mg/kg；蒽醌含量超标率34.1%(92/270)；其中不同品种茶叶蒽醌污染程度，砖茶重度污染居多㊁绿茶以轻度污染为主，与本文研究结果一致㊂
虽然茶叶中9,10-蒽醌污染残留较高，但因9, 10-蒽醌水溶性较低，在25ʎC时水中溶解度仅为1.35mg/L,logKow为3.39，以致于其在冲泡过程中不太容易浸出㊂已有文献报道[22]残留物在茶汤中的浸出效率取决于其物理化学性质如水溶性，分配系数(logKow)和蒸气压等，水溶性越高或者分配系数越低其浸出率也就越高㊂Xuan Wang等[17]试验发现当浸泡温度为25~100ħ时，茶叶中9,10-蒽醌浸出率范围为1.6%~13.7%㊂本文研究结果表明当茶叶用100ħ沸水冲泡5分钟后9,10-蒽醌浸出率仅为0.7%~18.6%，所以人体真正通过茶叶摄入的9,10-蒽醌低于预期水平㊂
由于9,10-蒽醌具有潜在致癌作用，建议相关机构尽快制定其每日容许摄入量(ADI)或暂定每周耐受摄入量(PTWI)及相关限量标准，为今后正确评估茶叶中9,10-蒽醌的膳食暴露风险提供科学依据㊂
利益冲突㊀所有作者均声明不存在利益冲突
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(收稿日期:2021-03-25)
(本文编辑：赵珣)