大连湾牡蛎蛋白的分离提取及分子量测定
崔韶晖，王艳颖，崔 杰，王岩，左 明，宁洪良
1、试剂
Tris—HCI、SDS、2-巯基乙醇、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、葡聚糖凝胶G-100
(SephadexG一100)为进口分析纯试剂；冰醋酸、NaCl、Glycine、甘油、溴酚蓝、过硫酸铵、考马斯亮蓝、甲醇、标准蛋白(Marker)、牛血清蛋白等为国产分析纯试剂．
Tris—HCI、SDS、2-巯基乙醇、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、葡聚糖凝胶G-100
(SephadexG一100)为进口分析纯试剂；冰醋酸、NaCl、Glycine、甘油、溴酚蓝、过硫酸铵、考马斯亮蓝、甲醇、标准蛋白(Marker)、牛血清蛋白等为国产分析纯试剂．
2、仪器
FSH-2型可调高速匀浆器、TDL-40B大容量低速离心机、旋转蒸发仪(BUCHI)、紫外分光
光度仪、垂直板电泳装置(安玛西亚)、凝胶成像分析仪(Image Station 440CF，KODAK)、
脱摇床、层析柱(1.0x30cm)等．
FSH-2型可调高速匀浆器、TDL-40B大容量低速离心机、旋转蒸发仪(BUCHI)、紫外分光
光度仪、垂直板电泳装置(安玛西亚)、凝胶成像分析仪(Image Station 440CF，KODAK)、
脱摇床、层析柱(1.0x30cm)等．
3、实验方法
1制备牡蛎匀浆
用自来水清洗新鲜牡蛎，除去内脏，再用去离子水冲洗干净，取5个为一组放入匀浆杯中，
用自来水清洗新鲜牡蛎，除去内脏，再用去离子水冲洗干净，取5个为一组放入匀浆杯中，
调速7000～10000转将牡蛎匀浆破碎成浆状组织液体．
2冰醋酸粗提牡蛎中蛋白组分
向匀浆液中滴加足量的冰醋酸，边滴加边用玻璃棒搅匀，直至匀浆液不再粘稠为止，静置
10min，使冰醋酸与蛋白充分反应，移人离心管中离心分离，转速4000r／rain离心20分钟，反复提取2次，合并上清液，用旋转蒸发仪浓缩提取。
2冰醋酸粗提牡蛎中蛋白组分
向匀浆液中滴加足量的冰醋酸，边滴加边用玻璃棒搅匀，直至匀浆液不再粘稠为止，静置
10min，使冰醋酸与蛋白充分反应，移人离心管中离心分离，转速4000r／rain离心20分钟，反复提取2次，合并上清液，用旋转蒸发仪浓缩提取。
大鼠肝细胞过氧化物酶体的提取
骆子生 王敏彦 姜玲玲
1. 1 动物
健康SD大鼠,体重300 g左右，鼠龄2～3个月。由河北省实验动物中心提供。
1. 2 试剂
所用试剂均为国产分析纯试剂。
1. 3 主要仪器
日立80P—7超速离心机，RPS40T水平转头，日立UV330紫外—可见分光光度计。
4、过氧化物酶体的分离
大鼠断头处死后，立即取出肝脏，用冷生理盐水将血迹冲洗干净。
称取10g肝脏，用剪子剪碎后，加50ml提取缓冲液(蔗糖0.25mol/L，乙醇0.1%，Na3EDTA 1mmol/L，Tris-HCl ，pH7.4 ，10mmol/L)，在冰浴中匀浆(以下操作均在冰浴中进行)。
④肝匀浆3000 r/min、离心10min，除去组织块，取上清液备用。
⑤向沉淀中加入50ml提取缓冲液再次匀浆，肝匀浆3000r/min、离心6min，弃沉淀(A)。将两次离心所得上清液合并，7000 r/min、离心5 min，取上清。13500 r/min、4℃离心20min,弃上清(B)，留沉淀。
⑥向沉淀中加入40ml缓冲液混悬后，再次13500 r/min、离心20 min，弃上清，取沉淀。用3ml缓冲液将沉淀悬浮，此为过氧化物酶体的粗提物(C)。
⑦在13ml的PA离心管中加入45.8% (w /w)的蔗糖液5ml，再缓慢加入37.4% (w /w)的蔗糖液4
ml，制成不连续梯度液。将混悬好的过氧化物酶体的粗提物(约4 ml)缓慢加在梯度液上，用RPS40T水平转头，慢加速至27500 r/min、离心2 h。
⑧样品被分成肉眼可见的三层分布状态(见图1)：上边一层是微粒体，中间一层是线粒体，最底部沉淀即是过氧化物酶体。收集管底的沉淀，用13ml提取缓冲液悬浮， 27500 r/min、离心2 h，洗去浓蔗糖溶液。
东亚钳蝎纤溶活性蛋白的分离纯化及其作用性质研究
黄锦兵
1、主要实验仪器
组织捣碎机：佛山市顺德区方胜电器实业有限公司
KDC-40低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司
JB-2型恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器有限公司
AUY220电子分析天平：梅特勒一上海
HC—TPll—5架盘药物天平：上海精科天平
KDC-160HR高速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司
DHG一9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司
TH-500梯度混合器：上海沪西分析仪器厂有限公司
HL-2恒流器：上海沪西分析仪器厂有限公司
BSE-100自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司
UV-180紫外检测仪：上海沪西分析仪器厂有限公司
XWT-S小型台式记录仪：上海自动化仪表三厂
KDC-40低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司
JB-2型恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器有限公司
AUY220电子分析天平：梅特勒一上海
HC—TPll—5架盘药物天平：上海精科天平
KDC-160HR高速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司
DHG一9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司
TH-500梯度混合器：上海沪西分析仪器厂有限公司
HL-2恒流器：上海沪西分析仪器厂有限公司
BSE-100自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司
UV-180紫外检测仪：上海沪西分析仪器厂有限公司
XWT-S小型台式记录仪：上海自动化仪表三厂
1810B自动双重纯水蒸馏器：上海建强玻璃仪器有限公司
梅特勒一托利多SevenEasy pH计：梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司
梅特勒一托利多SevenEasy pH计：梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司
2、主要实验试剂：
磷酸氢二钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂
磷酸二氢钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂
磷酸二氢钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂
硫酸铵：分析纯，天津市福晨化学试剂厂
三(羟甲基)氨基甲烷：分析纯，天津市大茂化学试剂厂
盐酸：分析纯，广州市东红化工厂
氢氧化钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂
乙二胺四乙酸二钠(EDTA)：分析纯，广州化学试剂厂
氯化钡：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司
聚乙二醇10000：实验试剂，天津市瑞金特化学品有限公司
氯化钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂
D45nm透析袋：美国进口
三(羟甲基)氨基甲烷：分析纯，天津市大茂化学试剂厂
盐酸：分析纯，广州市东红化工厂
氢氧化钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂
乙二胺四乙酸二钠(EDTA)：分析纯，广州化学试剂厂
氯化钡：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司
聚乙二醇10000：实验试剂，天津市瑞金特化学品有限公司
氯化钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂
D45nm透析袋：美国进口
DEAE-32纤维素：广东省汕头市西陇化工厂进口分装(沃特曼产品)
无水乙醇：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司
考马斯亮蓝G-250：USB，北京鼎国生物技术有限责任公司
无水乙醇：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司
考马斯亮蓝G-250：USB，北京鼎国生物技术有限责任公司
磷酸：分析纯，天津市大茂化学试剂厂
1总蛋白的提取
1溶液的配制：
pH=7.6，浓度为0.02mol/L磷酸钠缓冲液的配制取6.053g Na2HP4·12H20，0.4863g
NaH2P04·2H20定容至1L
pH=8.0，浓度为0.02mol/L Tris-HCl的配制取973.33μL浓盐酸，2.4228gTris定容至1L
2实验材料准备：
1．透析袋的处理：新的透析袋在使用前必须要进行前处理，具体方法如下：
⑴先把把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段。
⑵在大体积的2％(W/V)碳酸氢钠和lmmol/L EDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。计算2％(w/v)的NaHCO3溶液和lmmol/L EDTA(pH8.0)的用量：若m(NaHCO3)=2g，则V(NaHC03)=2/2％=100ml， 则需NaHCO3溶液l00ml。若需EDTA溶液500ml， 而m(EDTA)=1 ×l0-3mol/L×0.5L×292.25g/mol=0.1461g。即称取0.1461g的EDTA粉末，溶于水，定容至500ml即可。
⑵在大体积的2％(W/V)碳酸氢钠和lmmol/L EDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。计算2％(w/v)的NaHCO3溶液和lmmol/L EDTA(pH8.0)的用量：若m(NaHCO3)=2g，则V(NaHC03)=2/2％=100ml， 则需NaHCO3溶液l00ml。若需EDTA溶液500ml， 而m(EDTA)=1 ×l0-3mol/L×0.5L×292.25g/mol=0.1461g。即称取0.1461g的EDTA粉末，溶于水，定容至500ml即可。
(3)反复用蒸馏水冲洗透析袋的内部及外部。
(4)放在lmmol/L EDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。
(5)冷却后，存放于4℃冰箱内，必须确保透析袋始终完全浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时总须戴手套。
(6)使用透析袋前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。
注：步骤4，用lmmol/L EDTA(pH8.0)煮沸10分钟的操作，可代之以将透析袋装于盛满水松盖瓶内，在201bf/in2(1.379× 105Pa)高压下蒸汽灭菌l0分钟。
(6)使用透析袋前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。
注：步骤4，用lmmol/L EDTA(pH8.0)煮沸10分钟的操作，可代之以将透析袋装于盛满水松盖瓶内，在201bf/in2(1.379× 105Pa)高压下蒸汽灭菌l0分钟。
2．DEAE-32纤维素预处理：称取DEAE-32纤维素18g，采用以下方法前处理：
(1)加180mL离子水于DEAE-32纤维素中，浸泡溶胀24小时。
(2)倾去凝胶溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0mol/L HCl液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡0.5小时预处理后倾去。用去离子水洗涤至中性。
(3)倾去凝胶上层的水及悬浮碎片后，加入凝胶等体积的1.0mol/L NaOH液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡0.5小时处理后，用去离子水洗涤。洗涤过程中，用倾去法去细颗粒。
(4)重复步骤2的操作。
(5)倾去凝胶上层的水后，加入凝胶等体积的0.0lmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，用搅棒轻轻搅动平衡。倾去凝胶上层的Tris—HCl缓冲液，重复平衡3次。
(6)将DEAE-32纤维素凝胶溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡。将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入盛有Tris-HCl缓冲液的烧杯中，备用。
(1)加180mL离子水于DEAE-32纤维素中，浸泡溶胀24小时。
(2)倾去凝胶溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0mol/L HCl液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡0.5小时预处理后倾去。用去离子水洗涤至中性。
(3)倾去凝胶上层的水及悬浮碎片后，加入凝胶等体积的1.0mol/L NaOH液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡0.5小时处理后，用去离子水洗涤。洗涤过程中，用倾去法去细颗粒。
(4)重复步骤2的操作。
(5)倾去凝胶上层的水后，加入凝胶等体积的0.0lmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，用搅棒轻轻搅动平衡。倾去凝胶上层的Tris—HCl缓冲液，重复平衡3次。
(6)将DEAE-32纤维素凝胶溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡。将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入盛有Tris-HCl缓冲液的烧杯中，备用。
3、提取步骤：
1．取东亚钳蝎剪尾，分别对蝎尾和蝎身称重，高速组织捣碎机进行捣碎，加入5倍蝎尾和蝎身重量体积(V/W)的磷酸钠缓冲液，预冷，磁力振荡搅拌器搅拌30分钟，4℃浸提过夜。
2．滤液在4℃下8000r/min离心20分钟，取上清液，即为蝎尾蝎身粗提液。
3．采用(NH4)：S04溶液饱和度的方法，分别以40％、70％的盐饱和度对蝎尾蝎身蛋白质粗提液进行分段盐析，硫酸铵溶液饱和度的计算参见表2-1。
参照表2-1计算4096硫酸铵饱和度需要硫酸铵的质量，缓慢加入到蝎尾蝎身粗提液中，4℃预冷，放在磁力搅拌器上搅拌30分钟使硫酸铵完全溶解，4℃静置l小时，然后在4℃条件下8000r/min离心20分钟，手机上清液。采用同样方法调整硫酸铵饱和度到70％进行盐析，收集沉淀，用磷酸钠缓冲液溶解，4℃保存，备用。
3．采用(NH4)：S04溶液饱和度的方法，分别以40％、70％的盐饱和度对蝎尾蝎身蛋白质粗提液进行分段盐析，硫酸铵溶液饱和度的计算参见表2-1。
参照表2-1计算4096硫酸铵饱和度需要硫酸铵的质量，缓慢加入到蝎尾蝎身粗提液中，4℃预冷，放在磁力搅拌器上搅拌30分钟使硫酸铵完全溶解，4℃静置l小时，然后在4℃条件下8000r/min离心20分钟，手机上清液。采用同样方法调整硫酸铵饱和度到70％进行盐析，收集沉淀，用磷酸钠缓冲液溶解，4℃保存，备用。
4．把收集得到的待测液装入预先处理好的45mm透析袋中，先用双蒸水4℃透析4小时，然后用Tris-HCl缓冲液进行透析，中间多次换缓冲液，至到用氯化钡溶液检测不出白硫酸钡沉淀为止。
5．把透析完的透析袋放到聚乙二醇10000中进行浓缩，过滤浑浊的待测液，4℃保存备用。最后用沸水煮用过的透析袋二十分钟，然后放入双蒸水中，冰箱保存即可重复使用，聚乙二醇放入烘箱蒸干其水分以便下次使用。
怀头鲇胃黏膜蛋白酶分离提纯条件的筛选
刘伟，曾真，战培荣
胃蛋白酶的粗提(粗分级)
1)采样时间。怀头鲇胃黏膜蛋白酶活性在摄食后3 h达到高峰，故在喂食后3～4 h进行采
样。
2)酶原抽提。在冰盘上解剖怀头鲇并剪下整个胃部，用蒸馏水清洗，再剪去胃外壁肌肉，保留内壁黏膜组织。将黏膜组织剪碎，加入4倍质量的双蒸水，用高速匀浆器以10 000～13 00
1)采样时间。怀头鲇胃黏膜蛋白酶活性在摄食后3 h达到高峰，故在喂食后3～4 h进行采
样。
2)酶原抽提。在冰盘上解剖怀头鲇并剪下整个胃部，用蒸馏水清洗，再剪去胃外壁肌肉，保留内壁黏膜组织。将黏膜组织剪碎，加入4倍质量的双蒸水，用高速匀浆器以10 000～13 00
0 r/min低温匀浆2 h(每5 min间歇匀浆l min)。若匀浆中有较多组织碎块，应尽可能剪碎黏膜组织。再将匀浆液以8 000 r/min冷冻离心15 min，上清即为胃蛋白酶原抽提液，蛋白酶活力为0.516 IU/mg。
3)酶原激活。用1 mobuchil/L的盐酸将胃蛋白酶原抽提液pH调至2.8，静置2 h，酶原被激活为有活性的蛋白酶，即胃蛋白酶激活液，蛋白酶活力为61．95 IU/mg。将胃蛋白激活液用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至4.2，并于4℃下保存。
3)酶原激活。用1 mobuchil/L的盐酸将胃蛋白酶原抽提液pH调至2.8，静置2 h，酶原被激活为有活性的蛋白酶，即胃蛋白酶激活液，蛋白酶活力为61．95 IU/mg。将胃蛋白激活液用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至4.2，并于4℃下保存。
人单核细胞表面晚期氧化蛋白产物结合蛋白的分离
孙岩
晚期氧化蛋白产物的制备分离
AOPP的形成主要依赖于氯化氧化剂，特别是HOCI的作用，而在血浆中，HSA是形成AOPP最主要的蛋白组分，因此目前主要通过HSA--HOCI孵育法由体外制备AOPPf称为AOPP -HSA)。我们首先以此种方法制备AOPP—HSA粗纯品，继而先后通过Sephadex G-100凝胶层析和Mono—Q阴离子交换一HPLC分离其中I鬟JAOPP—HSA，测定其纯度。
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