基于UPLC—Q—TOF—MS／MS技术的短管兔耳草化学成分快速识别研究
采用超高效液相谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术快速分析鉴别短管兔耳草的化学成分，为其临床应用提供参考依据，试验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS仪器，YMC-Triart C18谱柱 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm），以乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱；质谱采用电喷雾（ESI）离子源，在负离子模式下采集数据，通过保留时间、精确分子离子峰和二级质谱裂解碎片，并结合参考文献，对短管兔耳草成分进行鉴定，该实验共鉴别出22个化合物，其中黄酮类化合物11个，苯乙醇苷类化合物6个，环烯醚萜类化合物1个，有机酸类化合物4个。UPLC-Q-TOF-MS/MS方法能快速鉴别短管兔耳草中的各类化学成分，方法简单，快速，可为短管兔耳草的临床应用提供物质依据。
标签： 短管兔耳草；UPLC-Q-TOF-MS/MS；化学成分；快速鉴别
[Abstract] The chemical constituents of Lagotis brevituba were rapidly determined and analyzed by using ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time of flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS/MS） method，providing material basis for the clinical application of L. brevituba. The separation was performed on UPLC YMC-Triart C18
（2.1 mm×100 mm，1.9 μm） column，with acetonitrile-water containing 0.2% formic acid as mobile phase for gradient elution. The flow rate was 0.4 mL·min-1 gradient elution and column temperature was 40 ℃，the injection volume was 2 μL. ESI ion source was used to ensure the data collected in a negative ion mode. The chemical components of L. brevituba were identified through retention time，exact relative molecular mass，cleavage fragments of MS/MS and reported data. The results showed that a total of 22 compounds were identified，including 11 flavones，6 phenylethanoid glycosides，1 iridoid glucosides，and 4 organic acid. The UPLC-Q-TOF-MS/MS method could fast identify the chemical components of L. brevituba，providing valuable information about L. brevituba for its clinical application.
[Key words] Lagotis brevituba；UPLC-Q-TOF-MS/MS；chemical constituents；fast identification
藏藥是我国传统医药的重要组成部分，生长环境独特药用效能高，尤其对某些特殊疑难病症如风湿病、心血管病、胃病等方面显示出其他药物无可替代的作用[1]。这些特性说明藏药具
有非常重要的开发价值。如何快速鉴别藏药化学成分，为药效活性提供参考依据是当前藏药进一步现代化开发与应用亟待解决的关键问题之一。
短管兔耳草系玄参科兔耳草属植物Lagotis brevituba Maxim的干燥全草，是著名藏药“洪连”的主要基原植物，也是2015年版《中国药典》收载仅有的9种藏药材之一。其应用历史悠久，在著名藏医古籍《月王药诊》、《四部医典》及《晶珠本草》中均有记载，并被《四部医典》列为藏草药之首，具有极高的药用价值。藏医学在临床上用于肾炎、高血压、动脉粥样硬化症、全身发烧、肺病、湿热泻痢、阴道流黄黑液物、综合性毒性中毒及“心热”等多种疾病。前期研究表明短管兔耳草具有抗炎[2]、抗癌[3]、抗阿爾茨海默病[4]、降尿酸[5]、抗肝损伤[6]等多种作用。这表明藏药短管兔耳草具有很好的开发与应用前景。物质基础的阐明是药物现代化开发的先决条件，因此如何快速阐明短管兔耳草化学成分，为临床药效提供物质依据，已成为其现代化开发的决定性因素。
目前短管兔耳草化学成分研究多采用传统分离纯化方法[7-8]。这些方法费时耗力，难以满足短管兔耳草化学成分快速鉴别的需要。近年来，液质联用技术集超高效液相谱的快速高效分离能力和MS的高灵敏度、高选择性于一体，在中药领域应用日益广泛，已成为分离鉴定
各种化合物的重要手段[9-10]。因此，本实验以藏药短管兔耳草为研究对象，应用超高效液相谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术对其甲醇提取物的化学成分进行研究，根据其准分子离子以及二级碎片离子、文献数据等鉴定短管兔耳草的化学成分，以为短管兔耳草临床应用及现代化开发提供支撑。
1 材料岛津LC-30A超高效液相谱仪，PDA紫外检测器；YMC-Triart C18谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.9 μm）；Triple-TOF 5600+高分辨质谱仪，配备 ESI 离子源及 Analyst 1.6 数据处理软件（美国AB Sciex公司）；KQ-5200DB型超声清洗机（昆山市超声波仪器公司）；AL204 型电子分析天平[Mettler Toledo 仪器（上海）有限公司]；Millipore-Simplicity 超纯水处理系统（德国默克密理博公司）；BUCHI电动旋蒸蒸发仪（瑞士步琪公司）。
大车前苷对照品（纯度≥98%，批号MUST-16041508）、 金丝桃苷对照品（纯度≥98%，批号MUST-16032113）、木犀草素对照品（纯度≥98%，批号MUST-16011015）均购自成都曼思特生物科技公司；毛蕊花糖苷（纯度≥97%，实验室自制）；松果菊苷（纯度≥98%，批号P23N7F25444）购于上海源叶生物科技有限公司。乙腈（谱纯，美国anaour公司），甲酸[谱纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司]，其余试剂为分析纯。短管兔耳草购于成都荷花池药材市场，经钟国跃教授鉴定为短管兔耳草L.brevituba的干燥全草。
2 方法
buchi2.1 供试品溶液制备
短管兔耳草全草粉碎，称取2.0 g，于锥形瓶中加入50 mL 75%甲醇超声提取30 min，重复3次。抽滤，旋干，用75%甲醇定容至25 mL量瓶中，0.22 μm微孔滤膜过滤，供UPLC-Q-TOF-MS/MS分析。
2.2 标准品溶液的制备
分别精密称取对照品金丝桃苷2.18 mg、大车前苷2.33 mg、木犀草素2.24 mg、松果菊苷2.07 mg、毛蕊花糖苷2.45 mg分别置于5 mL量瓶中，用75%甲醇溶解并稀释至刻度，分析前过0.22 μm微孔滤膜，备用。
2.3 LC-MS 条件
2.3.1 谱条件 YMC-Triart C18分析谱柱 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流动相0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～5 min，5%～15% B；5～14 min，15%～16%
B；14～28 min，16%～22% B；28～33 min，22%～95% B；流速0.4 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量2 μL。
2.3.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子化源（ESI），负离子模式；质量扫描范围m/z 50～1 200；喷雾电压-4 500 V；雾化气温度550 ℃；气帘气30 psi（1 psi=6.895 kPa），辅助气50 psi；去簇电压（DP）-100 V；采用AB analyst TF软件采集数据，TOF-MS一级预扫描和触发的二级扫描TOF-MS/MS离子累积时间分别为250，150 ms，碰撞能量CE 40 eV，CES碰撞能量叠加为（40±10） eV。
2.4 数据处理
采用AB Sciex公司Peakview 1.6数据处理软件对UPLC-Q-TOF-MS/MS采集的数据进行处理。
3 结果
3.1 短管兔耳草中化学成分确认
按照1.4.2项下方法对75%甲醇提取短管兔耳草药材成分进行定性分析，（-） ESI-MS 的质谱总离子流图（TIC）见图1。应用Peak View 1.6软件分析其中各化学成分的保留时间及其质谱信息，并结合其分子离子峰与对照品、文献报道的数据进行对比，再对其中的化学成分进行辨别，从而鉴定出短管兔耳草提取物中22个化合物，鉴定结果见表1。由于黄酮化合物在质谱中有相似的规律，其具有相同的母核，本次实验选择了具有代表性的化合物7，13，19，21详细分析其裂解过程，苯丙素类选择化合物9，10，15分析其裂解過程，有机酸类化合物选择化合物20分析其裂解过程。
3.2 黄酮苷元裂解规律以及其二级碎片离子
化合物7分子组成 C21H20O12，母离子为m/z 463.100 8[M-H]-，相对分子质量为464。其脱去1分子吡喃半乳糖基得到m/z 301.012 4的碎片离子峰。继而脱去1分子CHO产生m/z 272.030 8，再脱去1个OH得到m/z 255.029 7的碎片离子峰，最后脱去1分子CO得到m/z 227.033 2的碎片离子峰[16]。与对照品金丝桃苷比较，发现其液相出峰时间与其相同，从而证明化合物7为金丝桃苷。
化合物13分子组成C28H28O18，母离子为m/z 651.131 2[M-H]-，相对分子质量为652。二
级碎片离子m/z 351.060 8显示双葡萄糖醛酸片段，母离子失去1个双葡萄糖醛酸片段得到m/z 299.057 9的碎片离子峰。其碎片离子峰推断为香叶木素苷元。苷元发生裂解失去1个CH3得到m/z 284.035 7碎片离子。香叶木素苷元同时發生RDA裂解产生m/z 193.036 4和m/z 131.035 8黄酮特征碎片离子。根据文献[15]，推测化合物13为香叶木素-7-O-双葡萄糖醛酸苷。其裂解见图2。
化合物19分子组成 C15H10O6，母离子为m/z 285.042 7[M-H]-，相对分子质量为286。二级碎片离子峰m/z 257.044 0为分子失去1分子CO，继续失去1分子CO产生m/z 229.052 0的碎片离子峰。同时母核发生RDA裂解分别产生m/z 150.999 3，133.058 2 的碎片离子，这2个碎片离子都是黄酮环裂解的特征离子，可以推断其为黄酮类化合物。其中m/z 133.025 4 的碎片离子为B环和C环中的残基组成的，所以其丰度远大于m/z 150.999 3的丰度[25-26]。之后又与对照品木犀草素进行比对，化合物19出峰时间与对照品相同，质谱裂解规律一致。从而确认化合物19为木犀草素。具体裂解过程见图3。化合物21分子组成C16H12O5，母离子m/z 283.059 6[M-H]-，相对分子质量为284。其裂解脱去甲基产生m/z 268.038 2的碎片离子峰，为基峰。该基峰离子继续发生裂解，脱去1分子CO生成m/z 240.042 0的碎片离子峰，继而丢失1个CHO产生m/z 211.038 2碎片离子峰。同时此化合物发生了RDA反应，产生m/z 15
1.000 3的黄酮特征碎片离子峰。根据文献[20]，推测化合物21为刺槐素。裂解方式见图4。