单宁酶开题报告
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单宁酶是一种水解酶，能水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键，生成没食子酸和其他化合物。在酶制剂工业发达的国家，如日本、美国，单宁酶的基础理论和应用研究工作开展得较早，并已在茶饮业中取得了较好的经济效益。随着国民经济的不断发展，人们生活水平的不断提高，单宁酶得到了更广泛的应用。人们已在皮革业、饲料业、化妆品业等方面开发了单宁酶的多种用途。中国是个茶叶大国，而且可开发资源丰富，单宁酶的应用前景十分广阔。单宁酶的性质国外对单宁酶性质的研究相对较多，也较深入，为今后的应用研究提供了有价值的参考。单宁酶的酶学性质来源于不同菌种的单宁酶动力学性质稍有区别。Yamada H. 等报道的黄曲霉单宁酶活性稳定pH值范围最窄，为5. 0～5. 5另据韩国的Chae Soo-Kyu 等报道的曲霉菌种AN-11单宁酶活性稳定的pH值为5. 0～6. 5其他菌种单宁酶活性稳定pH 范围大都在3.0～8.0之间，最适pH值为4～6，热稳定范围在70～80 ℃以下，最适反应温度为35～60 ℃。日本科学家Hdeaki
-4mol/L; Km (以葡萄糖212没食子酸为底物) 为1.4×10mol/L；Km (以没食子酸甲酯为底物)
-4为8.6×10mol/L。经6mol/L盐酸胍处理后，单宁酶将发生不可逆失活，各种金属离子以及
EDTA 对酶活性影响报道结论不一。
单宁酶的物理化学性质
纯单宁酶在紫外光区280nm 处，有一个最大吸收峰，在浓度为10% ，比皿为1 cm×1 cm 条件下，吸光系数a为11.8，260nm处吸光度与280nm处吸光度之比为0. 51。
Sadaak i Iibuchi，Chae Soo-Kyu分别用凝胶过滤法测定出它们各自选育的菌种单宁酶相对分子质量都为200 000。O sao A dachi等分别用沉降法和电泳法测定黄曲霉单宁酶相对分子质量，分别是194 000和192 000。Chantal等测出黑曲霉LCF8单宁酶相对分子质量为186 000，其等电点在4左右。Chantal和Chae Soo-Kyu在对各自提纯的酶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时发现，单宁酶分子由2种亚基组成，但这个结果与Kengi Aoki对酵母单宁酶结构分析的结果有所不同。后者用同样的方法，只得到一条电泳蛋白带。
O sao A dachi等进一步研究了黄曲霉单宁酶的其他结构特性，其分子中氮含量为12.9% (凯氏定氮法)，用二硝基氟苯法测氨基末端，有2个DNP-氨基酸产物，分别为DNP-丙氨酸与DNP-精氨酸，这一结果进一步指明黄曲霉单宁酶为2种亚基组成。单宁酶另一重要特征是，它为一种糖蛋白，而不同来源的单宁酶糖含量有差异。例如，黄曲霉单宁酶糖基占总相对分子质量的25% ，糖基为甘露糖。Chantal从黑曲霉中提取的单宁酶，其糖基含量高达43% ，而酵母单宁酶糖基含量为62%。Parthasarathy N. 等探明其
选育的黑曲霉单宁酶碳水化合物为
葡萄糖和甘露糖，肽链通过丝氨酸和苏氨酸与糖基相连接。糖基与酶的功能关系还未见报道。单宁酶的催化性质
Saddak i Iibuchi等对米曲霉单宁酶的催化途径、底物的专一性和阻遏
buchi作用进行了研究。结果表明，单宁酶催化葡萄糖酸酯，水解成没食子酸与葡萄糖。中间产物为1，2，3，4，6-黄酰单宁和2，3,4，6-四酰单宁以及两种没食子酸葡萄糖。反应途径如下所示：
单宁酶只能水解没食子酸化合物中的酯键，不对底物类似物如甲基间二羟甲酸盐起作用。酶对底物是否有催化作用决定于ES复合物的形成。ES复合物形成条件有3点：a.只要是没食子酸形成的酯，对醇没有限制；b.酚羟基在苯环上相对位置不同，将影响其与酶的结合作用；c.形成的ES复合物中酚羟基形成的酯键可被水解，而其他酯键或羧基由于没有直接与酶结合，不能发生以上的反应。酶反应受到含酚羧基的底物类似物的竞争性抑制，但2,6--二羟基苯甲酸是非竞争性抑制。这表明尽管底物与酶结合的复合物都是没食子酸化合物，但因酶与底物结合位点不同，它对某些酚羟基底物起作用，而对另一些底物类似物又不起作用。单宁酶的来源
单宁酶主要来源于微生物，菌种主要为曲霉菌。另外，青霉、酵母、细菌、植物也有产单宁酶的报道，国外资料报道的各种产酶菌种列于表1. 这些菌种都是以单宁作为诱导物来产生
单宁酶的，充分证明单宁酶为一种诱导酶。Doi Seniji等从基因表达调
控方面对菌种产生单宁酶进行了探索, 证明指导单宁酶生物合成的mRNA极不稳定, 而可迅速阻止单宁
酶的产生。
单宁酶的提取与纯化
单宁酶的提纯技术随着蛋白质提纯技术的进步而不断提高。在分离纯化此酶的过程中，主要困难表现在破壁取酶。曲霉单宁酶为胞内酶，它分布于真菌的细胞壁与细胞膜之间，结合得非常牢固，可以认为是固定在细胞中。要充分提取酶，首先面临的是如何有效地破壁，使酶最大限度地释放出来。利用超声波、石英砂研磨、渗透法等经典方法破壁时，酶得率较低。法国科学家利用冻融法，再加入伴刀
豆球蛋白(凝集素) 破壁，此法是在菌种产酶高峰过后，待胞壁韧性降低时采用的，酶得率虽较第一类方法有所提高，但损失仍然严重。翌年，他们将生产几丁质酶的链霉素菌丝体与产单宁酶菌种保温培养一段时间后，53%的胞内酶得以释放。在此之前，也有关于几丁质酶、α-葡聚糖酶或β-葡聚糖酶破壁的报道。酶法破壁大大提高了酶得率，但也不可避免地给后期提纯工作带来了麻烦。单宁酶的分离提纯手段大致可以归纳为以下几条路线：
硫酸铵沉淀
A、细胞破壁（物理方法）→利凡诺（乳酸-6，9-二氨基-7-氧基吖啶）沉淀→ 丙酮沉淀
阴离子交换柱→葡聚糖凝胶过滤
B、细胞破碎（物理方法）→超滤（200 000）→超滤（100 000）
→Protein Pak SW300
C、细胞破壁→聚合物沉淀→透析
D、细胞破壁（几丁质酶等）→反向胶束系统。
上述几条路线表明：为适应单宁酶商品化需求，单宁酶的提纯技术在从复杂且成本高的实验室提纯手段向简明的工业化生产过渡。Chantal报道的反向胶束系统可有效地提高酶产量，大大地缩短纯化过程。反向胶束系统是80年代初期兴起的一项蛋白质提纯技术，它的基本原理是利用表面活性剂在有机溶剂中形成一个个胶团，极性基团向内排列，而形成极性区域，胶团内部能为酶提供最佳微环境，在热力学上稳定且表面活性剂的性质和水含量最佳化时，反向胶束系统中的酶稳定性可大大提高。酶分子可容纳于此，这样酶分子就可与其他杂质分
开。与其他提纯手段相比，反向胶束系统更适于工业化生产。
单宁酶活力测定方法
单宁酶活力测定方法有滴定法、紫外分光光度法、比法以及高效液相谱法, 各种方法基本原理简述如下.
滴定法
由于单宁在单宁酶作用下分解生成游离的没食子酸，可用碱对之进行滴定，确定底物单宁的减少量而测得酶活力。但是，因为缓冲液对碱的缓冲力以及单宁本身的褐干扰了滴定终点，再者，随溶液pH值增高，单宁会逐渐发生水解，将影响测定结果的稳定性与准确性。紫外分光光度法
日本Sadaaki Iibuchi 等于1967年建立了紫外分光光度法，基本原理是通过测定底物单宁反应前后在紫外光区310nm处光密度的变化，求得单宁酶活力。这个方法成为以后单宁酶活力测定的经典方法。此法简单快捷，且误差在1%～3%之间，但底物单宁纯度要求非常高。1995年, Sadaaki Iibuchi建立的紫外分光光度法基础上，改建了单宁酶活力测定方法，以没食子酸丙酯(PG)为底物，在270 nm处,PG浓度在一定范围内与吸光度成正比，根据此原理建立的酶活力测定方法，简便灵敏，重复性好。
视读法
1993年，澳大利亚科学家O saw e R.等建立了细菌单宁酶活力测定方法，其根据有两点： a. 单宁可水解生成游离的没食子酸；
b. 没食子酸在空气中暴露被氧化，颜从绿变成褐。通过比求其变化量而测得酶活力。
高效液相谱法
1994年, 法国的Chantal Barthomeuf等用高效液相谱法连续测定反应过程中产物没食子酸变化量，直接测定出酶反应的初速度，此法迅速准确，但对仪器要求较高。
篇二：单宁酶
单宁酶及其在茶饮料中的应用
【摘要】单宁酶可水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，主要由曲霉属等微生物发酵生产。单宁酶防止冷混浊、提高提取率、保持泽和减轻苦涩味的作用在茶饮料工业中有广泛的应用。
【关键词】单宁酶；茶饮料；应用
单宁酶又称单宁酯酰水解酶（EC3.1.1.20），它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖，可广泛应用于制革、酿酒、医药、饮料等领域。 1单宁酶的性质和生产
1.1单宁酶的来源和性质
单宁酶除存在于富含单宁的植物中外，还广泛存在于微生物中。能够产生单宁酶的微生物来源十分丰富，主要是真菌类的曲霉属、青霉属和根霉属，尤其是曲霉属中的黑曲霉、米曲霉和黄曲霉；此外，酵母菌、寄生内座壳菌、巴斯德菌、茄形镰刀菌和绿木霉等也可产生单宁酶。
单宁酶是一种糖蛋白，不同来源的单宁酶其分子量和糖链的含量有所差异，酶蛋白由2-8个单体聚合而成，糖基含量由12%到62%不等。不同来源的单宁酶温度和pH稳定性不同：最适温度较高的50-60℃，一般在30-40℃之间，热稳定范围在60-70℃以下；来源于真菌和植物的单宁酶的最适pH一般为4.0-6.0，pH
稳定性范围一般是3.0-7.0之间，细菌单宁酶的最适pH一般偏中性[2]。金属离子对单宁酶活性的影响也有所不同：Libuchi S等[3]发现许多离子对单宁酶无活化
作用，但Zn2+和Ca2+可抑制酶活，另外EDTA溶液会使酶完全失活，而Aoki K[4]等发现EDTA对酶活无明显影响。Rajakumar G S等[5]发现Cu2+，Zn2+，Fe2+，Mg2+均对酶活力有显著影响。郭鲁宏等[6]研究发现除了Mn2+，Zn2+抑制酶活之外，其它金属离子对酶活均无明显的激活或抑制作用。Kar B 等[7] [41]研究表明Mg2+、Hg+ 可提高单宁酶活力， Ba2+、Ca2+、Zn、Hg、Ag 会抑制酶活力，Fe、Co 完全抑制酶活。
1.2单宁酶的发酵生产
单宁酶是一种诱导酶，可由微生物在单宁酸存在的条件下诱导产生的，目前对单宁酶发酵生产研究的重点多集中在曲霉和青霉上，常通过诱变育种选育和改良生产菌株以及通过优2+++3+2+
化发酵条件等途径来提高发酵产酶活力。如Libuchi等[1]以Asp oryzae 为出发菌株，以单宁酶为诱导物，探讨了菌株产单宁酶的最适培养条件。Aoki K
等[4]以酵母属的Candida sp K-Ⅰ为出发菌株，以单宁为诱导物，探讨了培养的
最适条件，发现添加了3%的单宁所得的单宁酶积累量最多。Bradoo S等[8]对产单宁酶的日本曲霉进行摇瓶发酵培养条件优化，将酶活力提高了13%。龚加顺等[9]
利用离子注入技术诱导得到一株单宁酶高产的9701菌株，其摇瓶培养的酶活力高达13.0l IU/ml，比出发菌株9401的酶活力高了2.89倍，且产酶性能稳定，重复性好；对另一株单宁酶高产菌株进行产酶条件优化后，获得了53.58mo1/s的高产酶活力。王征等[10]对黑曲霉的产酶发酵条件进行优化研究，获得316U/m1的较高酶活力。刘如石等[11]对黑曲霉NO.3菌株产酶发酵条件进行优化研究，最高酶活力可达144.25U/100mL发酵液，酶比活力为17.71。近期余钧池等[12]采用先培养菌体后再诱导产酶的方式，在诱导剂浓度为1.5%，诱导培养基初始pH5.0，30℃培养48h的条件下，发酵米曲霉得到的单宁酶活力相当于167.4U/ml发酵液。
基因工程育种具有能定向、稳定遗传、目的性强、育种周期短和能克服远缘杂交的障碍等优点，国内外都开展了构建高产单宁酶基因工程菌的研究。Hatamoto O等[13]克隆了米曲霉单宁酶的基因，用3个脱氧核糖核苷酸探针按照
单宁酶N-末端和内在的氨基酸序列合成了单宁酶基因。单宁酶低产菌株米曲霉AO1被包含单宁酶基因的质粒pT1转化后，转化株的单宁酶活力增加了，且与转化的质粒数成比例。陈志仕克隆并分析了米曲霉单宁酶基因序列，构建了含单宁酶基因的载体，实现了在大肠杆菌（E.coli）和毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达。郑穗兰[15]改造了重组米曲霉单宁酶基因的表达质粒，成功地进行了基因表达框架的改造，通过转化筛选获得了转化子并进行了摇瓶表达的初步摸索。ZHONG X F 等
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