程妍;欧阳向硕;梁田;张志荣
【摘 要】以邻羟基苯乙酮为初始原料,通过缩合反应合成了2-{2-[2-(4-羟基苯基)乙烯基]苯并吡喃-4-)-丙二腈(BPAD-2),并通过1 H-NMR与MS确认结构;考察所制备探针的荧光光谱;通过荧光染考察探针的Aβ结合标记;通过荧光成像考察探针的血脑屏障通过能力.结果表明BPAD-2的最大发射波长为658 nm;BPAD-2荧光标记的Aβ呈亮红;BPAD-2尾静脉注入正常小鼠后脑内显示荧光信号,10 min内荧光强度达到最高,随着时间延长荧光强度逐渐减弱.说明苯并吡喃结构的BPAD-2具有近红外荧光性质,并显示良好的Aβ荧光标记和血脑屏障通过能力.
【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2016(053)001
【总页数】5页(P193-197)
【关键词】Aβ;苯并吡喃;荧光标记;阿尔茨海默病
【作 者】程妍;欧阳向硕;梁田;张志荣
【作者单位】四川大学药学院,四川成都610041;四川大学药学院,四川成都610041;四川大学药学院,四川成都610041;四川大学药学院,四川成都610041
【正文语种】中 文
【中图分类】R96
β-淀粉样蛋白(Aβ)，是淀粉样前蛋白(APP)在脑神经细胞壁β-及γ-分泌酶切割下形成的38～43个氨基酸组成的肽链，以β-折叠构型的多聚体或不溶性纤维的形式存在.正常的衰老过程中脑内Aβ的产生与清除处于平衡状态.脑内Aβ的过量产生、聚集、沉积导致一系列神经细胞凋亡过程而最终导致阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)等疾病的发生发展[1, 2].因此，研究在体观察与检测Aβ的方法，可为AD的早期诊断、效果评价以及药物的研究等提供极大便利.
分子影像技术通过对活体内的重要分子，特别是对疾病的产生、发展有重要作用的基因或分子及其传导途径进行成像，具有无创、实时等优势，可从分子水平为疾病的发生、发展等提
供重要信息[3, 4].光学成像领域中新兴的近红外荧光成像(near-infrared fluorescence imaging)，在其光谱范围(600-900 nm)内生物体的自发荧光干扰较小；能穿透更深层的组织，实现对深层组织和器官的探测与成像[5].因此，利用近红外荧光成像技术对Aβ进行在体造影是可行的[6, 7].荧光成像的关键在于寻合适的荧光探针用于标记体内的Aβ.刚果红是用于Aβ体外染的经典染料，但因其分子大且结构中带电荷，不易通过血脑屏障进入脑内，因而不适合用于Aβ的在体标记.本研究设计了一种不同于刚果红结构的具有推-拉电子结构的苯并吡喃小分子染料BPAD-2，并初步探讨了其荧光性质、Aβ斑块标记和血脑屏障通过能力.
2.1 材 料
中压柱层析系统(Buchi，瑞士)、400 MHz核磁共振仪(Varian INOVA-400 1H-NMR，美国)、Agilent 6410B型高效液相谱-质谱联用仪(Agilent，美国)、高效液相谱仪(岛津，日本)、CM1950冰冻切片机(Leica，德国)、高速冷冻离心机(Beckman，美国)、Aviovert 40 CFL荧光倒置生物显微镜(Zeiss，德国)、QuickView 3000活体发光成像仪(BioReal，奥地利).
buchi邻羟基苯乙酮(99%，阿拉丁试剂)、钠(AR，科龙化工试剂)、对羟基苯甲醛(AR, 科龙化工试剂)、丙二腈(99%，西亚试剂)，有机溶剂均为分析纯.
2.2 方 法[8]
2.2.1 合成方法 1.2.1 1-(2-羟基苯基)-1，3-丁二酮的制备(1) 邻羟基苯乙酮9.93 g(72.9 mmol)溶于150 mL乙酸乙酯后，加入钠6.01 g(261.0 mmol)，室温下反应3 h，溶液由黄变为土黄.反应结束后，抽滤，将所得滤饼溶于300 mL水中，用冰醋酸调节pH至7，搅拌过夜.抽滤，得到浅黄固体4.97 g.产率为32.6%.
1.2.2 2-甲基苯并吡喃酮的制备(2) 向100 mL圆底烧瓶中依次加入化合物1(4.44 g，24.9 mmol)、50 mL醋酸和4 mL浓硫酸，回流半小时.将热溶液倾倒入300 mL冰水中，用无水碳酸钠调节pH至7.二氯甲烷萃取后有机相用无水硫酸镁干燥，抽滤旋蒸，得到黄晶体3.10 g.产率为77.9%.1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.18 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.67-7.62 (m, 1H), 7.43-7.26 (m, 2H), 6.20 (s, 1H), 2.40 (s, 3H).
1.2.3 2-甲基苯并吡喃腈的制备(3)化合物2(3.10 g，19.4 mmol)溶于4 mL乙酸酐，再加入丙二腈(1.44 g，21.8 mmol)，回流21 h，旋蒸溶剂，向圆底烧瓶中加入5 mL水并回流30 min，抽滤，滤饼用乙醇重结晶，得到淡红固体1.58 g.产率为39.3%.1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.94 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.70-7.62 (m, 1H), 7.45-7.25 (m, 2H), 6.73 (s, 1H),
2.44 (s, 3H).
1.2.4 2-{2-[2-(4-羟苯基)乙烯基]苯并吡喃-4-}-丙二腈的制备(4，BPAD-2)化合物3(416.1 mg，2.00 mmol)和对羟基苯甲醛(268.4 mg，2.20 mmol)溶于10 mL正丙醇，再加入200 μL，回流10 h.加水终止反应，用乙酸乙酯/水萃取，乙酸乙酯层旋蒸得粗产物.粗产物经柱层析(乙酸乙酯/正己烷洗脱)纯化，得固体247.1 mg.产率39.6%.1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 8.92 (d, 1H, J=8.4Hz), 7.75-7.71(m, 1H), 7.60-7.47 (m, 4H), 7.45-7.43 (m, 1H), 6.95-6.84 (m, 3H), 6.68 (d, 1H, J = 16.0 Hz). MS: m/z 313 (M++H).
2.2.2 高效液相谱测定BPAD-2 谱条件：泵(LC-10AT)；紫外检测器(SPD-10A)；Cosmosil C18谱柱 (Nakalai Tesque, 5C18-AR-Ⅱ, 4.6 mm × 150 mm)；流动相(乙腈/水: 7/3)；流速(1.0 mL/min)；检测波长(λ = 254 nm).精密称取BPAD-2适量溶解于乙腈，并用乙腈稀释至1 μmol·L-1，取5μL进样，记录谱图.
2.2.3 荧光激发波长与荧光发射波长的测定 精密称取BPAD-2适量溶解于甲醇，并用甲醇稀释至1 μmol·L-1.应用荧光分光光度计进行荧光检测.固定激发/发射波长并400～750 nm连续扫描发射/激发波长，绘制波行图像.
精密称取BPAD-2适量溶解于乙醇，并用PBS稀释至1 μmol·L-1(乙醇含量1%).应用荧光分光光度计进行荧光检测.固定激发/发射波长并400～750 nm连续扫描发射/激发波长，绘制波行图像.
2.2.4 Aβ染 配制浓度为1 μmol·L-1的探针滴加覆盖APP/PS1转基因小鼠脑切片(10 μm)[9-11]，室温培育10min；切片按40%乙醇(2min)、40%乙醇(2min)、纯水(30 s)的顺序进行漂洗，风干后应用荧光倒置生物显微镜观察荧光斑点.配制0.125% 刚果红(Aβ染剂)滴加于直接相临的脑切片，按同法操作，用于确认切片脑Aβ斑点的位置.
2.2.5 正常小鼠脑成像 取BPAD-2(2.0 mg/kg，含20%二甲亚砜，70%生理盐水)，经尾静脉注射入正常小鼠体内(♀，6 w，昆明种小鼠，四川大学实验动物中心，3只/时间点).分别于注射后5、10、20、30以及60 min时断头取脑并称重.取未注射药液的小鼠脑作为空白对照.
利用QuickView 3000光学成像系统对各时间点的脑进行成像.激发光与发射光选择系统内自带波长(激发光：474 nm；发射光：586 nm).其他成像参数分别为：exposure time(1 sec)；vertical pixel shift speed(6.5)；horizontal pixel shift RO speed(1MHz)；EM gain(0)；binning(1×1).确定整脑为感兴趣区域(ROI)并计算荧光信号.调节空白对照脑信号为0 (sum = 0)
.荧光信号由QuickView 3000软件计算而得.最终的荧光信号通过脑重量进行校正(荧光信号/脑重量).
3.1 探针的设计与制备
分子识别与荧光技术是荧光探针应用的两个基本条件，苯并吡喃具有平面刚性共轭结构，是保持与Aβ亲和力的关键；在苯并吡喃的两端分别引入推电子基团(羟基)和拉电子基团(二氰基亚甲基)，通过中间的碳碳双键增加π-π*跃迁的共轭体系，形成推-拉电子作用的共轭结构，使探针分子产生的荧光向近红外光区移动.以邻羟基苯乙酮为初始原料，通过缩合反应合成了BPAD-2，并通过核磁共振氢谱、质谱进行了结构确认；运用高效液相谱进行BPAD-2的纯度确认，BPAD-2在4 min处出峰，纯度大于99% (图3).
3.2 BPAD-2的荧光性质
如图4所示，BPAD-2在甲醇中的激发与发射波长分别为479 nm和601 nm.当溶剂为PBS时，激发与发射波长红移，分别为500 nm和658 nm，具有近红外荧光特性.近红外光区内生物体的自发荧光干扰较小，在生物组织中穿透深度大, BPAD-2的光学性质显示了对Aβ进行近红外荧光成像的潜在能力.
3.3 Aβ染
为了考察对Aβ的选择性和标记能力，将BPAD-2与脑内Aβ斑块在室温下培育, 并通过刚果红对相临脑切片的染确认脑内Aβ斑块的位置.结果如图5所示，BPAD-2标记的荧光点与刚果红确认的Aβ斑块位置一致，标记点在显微镜下观察呈亮红荧光.染结果提示：BPAD-2能够选择性结合Aβ斑块，并有效地荧光标记Aβ斑块.
3.4 正常小鼠脑成像
为了考察血脑屏障通过能力，取正常小鼠经尾静脉注入BPAD-2后进行脑部的荧光成像.结果如图6所示，注入BPAD-2的正常小鼠脑内迅速显示荧光信号，注射后10 min内荧光强度达到峰值；随着时间延长，荧光强度逐渐减弱，到达60 min时脑内荧光强度已降为进脑量峰值的37%(图7).
理想的Aβ标记，一方面需保证荧光探针与
Aβ的选择性结合，另一方面荧光成像系统能够有效地捕获探针的荧光信号.近红外荧光染料的荧光团常具有较大的分子结构且带有电荷，因而不适合应用于脑内Aβ的标记.在设计探针
时，通过苯并吡喃的平面刚性共轭结构保持与Aβ的结合性；在苯并吡喃的两端分别引入推电子基团(羟基)和拉电子基团(二氰基亚甲基)，通过中间的碳碳双键增加π-π*跃迁的共轭体系，形成推-拉电子结构，使探针分子产生的荧光向近红外光区移动.脑内Aβ的染结果说明BPAD-2能够选择性结合并荧光标记Aβ斑块.这也是苯并吡喃染料第一次成功地对Aβ进行标记.
Aβ由神经细胞产生，并可进入脑脊液和血流，但主要倾向于形成聚集体或斑块沉积于脑内，并对神经元产生神经毒性.为了有效标记脑内Aβ，探针应能够通过血脑屏障进入脑内，因此考察了BPAD-2的血脑屏障通过能力.据文献报道，小于600 Da且脂溶性合适(logP 2-5)的分子能够以被动扩散的形式透过血脑屏障[9].BPAD-2的分子量为312，clogP为3.43(ChemDraw Ultra 8.0计算)；注入BPAD-2的正常小鼠脑内迅速显示荧光信号，提示BPAD-2通过血脑屏障进入脑内，且荧光信号能够被荧光成像系统捕获；荧光信号的迅速减弱说明游离探针在脑内的滞留时间短；由于正常小鼠脑内无Aβ，游离BPAD-2的快速排出有利于减少干扰荧光背景，从而有利于提高成像质量.
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