超高效液相谱-串联质谱法测定菠萝中11种酚酸
刘元靖1洪亚楠2李涛1叶剑芝1*
（1中国热带农业科学院农产品加工研究所，广东湛江524001；
2嘉兴职业技术学院，浙江嘉兴314000）
摘要为了探明菠萝中酚酸的种类及含量，本研究采用超高效液相谱-串联质谱法对菠萝果肉样品进行分析。结果表明：该方法灵敏性高、线性范围宽、检出限低，可以有效提高检测效率。菠萝中存在多种酚酸，包括游离型、游离酯型和结合型，且菠萝中的不同酚酸含量存在明显差异。其中异阿魏酸和反式肉桂酸含量较高，芥子酸、对香豆酸、咖啡酸、丁香酸、对羟基苯甲酸、3，5-二羟基苯甲酸、香草酸、鞣花酸和水杨酸含量次之。本研究对菠萝中的酚酸进行了定量分析，为评价菠萝的营养成分和功能活性物质提供了一定的参考。
关键词菠萝；酚酸；超高效液相谱-串联质谱法；营养成分
中图分类号O657.63；TS255.7文献标识码A
文章编号1007-5739（2023）21-0178-04
DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.21.044开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Determination of11Phenolic Acids in Pineapple by Ultra High Performance Liquid
Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
LIU Yuanjing1HONG Yanan2LI Tao1YE Jianzhi1*
(1Institute of Agricultural Products Processing,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang
Guangdong524001;
2Jiaxing Vocational and Technical College,Jiaxing Zhejiang314000)
Abstract In order to investigate the types and content of phenolic acids in pineapple,this study used ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry to analyze pineapple pulp samples.The results showed that this method had high sensitivity,wide linear range,and low detection limit,which could effectively improve detection efficiency.There were various phenolic acids in pineapple,including free type,free ester type,and bound type,and there were significant differences in the content of different phenolic acids in pineapple.Among them,the contents of isoferulic acid and tran
s cinnamic acid were higher,followed by the content of erucic acid,para coumarin acid,caffeic acid,syringic acid,para hydroxybenzoic acid,3,5-dihydroxybenzoic acid,vanillic acid,ellagic acid,and salicylic acid. In this study,the phenolic acids in pineapple were quantitatively analyzed,which provided references for evaluating the nutritional components and functional active substances of pineapple.
Keywords pineapple;phenolic acid;ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; nutritional component
酚酸是一种酚类物质，以苯甲酸和肉桂酸羟化衍生物为主，并以游离和束缚的形式存在，束缚的酚酸通常以酯键、醚键与许多化合物共同组成。其中羟化的肉桂酸衍生物主要有香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，它们通常以配糖方式与奎尼酸或葡萄糖酯化存在于食物中；而羟化的苯甲酸衍生物中最常见的有对羟基苯甲酸、香草酸和原二茶酸，同样以配糖物的形式存在于食物中。此外，酚酸是一类植物次生代谢产物，具有多种生物活性。在一定的条件下可表现出强抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌等作用[1-2]。近年来，酚酸作为抵抗癌症和心脏病的潜在保护因子，受到越来越多的关
基金项目农业农村部财政专项“农产品质量安全监管（风险评估）”（GJFP20220206）。
第一作者刘元靖（1988—），男，硕士，助理研究员，从事农产品检验检测工作。E-mail：****************
*通信作者
收稿日期2023-02-21
178
注，其部分原因是它们潜在的抗氧化活性、抗癌作用、对慢性疾病的保健作用以及在植物源食品中的广泛存在性。动物和人体自身不能够合成酚酸，主要通过食物来获取酚酸。菠萝是热带、亚热带地区常见的一类水果，分析菠萝中的酚酸含量可为菠萝的营养成分和功能物质分析评价提供参考依据。
目前，测定分析酚酸的方法主要有分光光度法[3]、薄层谱法[4-5]、毛细管电泳法[6]、液相谱法[7-14]等。但分光光度法存在局限性，只能测定样品中酚酸总量，而液相谱法、薄层谱法、毛细管电泳法存在耗时长、灵敏度低等问题。因此，还需继续探究设计更高效的测定方法对不同种类酚酸进行高灵敏检测。超高效液相谱-串联质谱法具有比普通液相谱法分离效果好、分析速度快、可以同时定量测定多组分等优点，在营养成分和功能物质的测定中得到了广泛的应用。方玲玲等[10]报道了超高效液相谱串联质谱法测定樱桃酒中的5种酚酸。
因此，本文采用超高效液相谱-串联质谱法对菠萝中11种酚酸（水杨酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、咖啡酸、芥子酸、鞣花酸、反式肉桂酸、异阿魏酸、香草酸、对香豆酸、3，5-二羟基苯甲酸）进行高灵敏测
定，并对每种酚酸的游离型酚酸、游离酯型酚酸、结合型酚酸进行了分析研究。该方法灵敏度高、检出限低、线性范围宽、选择性好，能为其他含酚酸样品的检测提供技术支持。
1材料与方法
1.1材料与试剂
在北京、重庆、广州、武汉等4个城市农贸市场各取样3个巴厘菠萝样品，每个样品3kg。将3个样品去皮后取可食用部分匀浆作为一个地区的一个样品。
试剂包括乙腈（谱纯）、正己烷（谱纯）、乙酸乙酯（谱纯）、甲酸（谱纯）、氢氧化钠（分析纯）、乙酸铵（分析纯）、抗坏血酸（分析纯），均购于上海安谱科技公司；盐酸（分析纯），购于湛江市科诚试剂公司。所有的试剂用前未经任何纯化处理。试验用水为Milipore超纯水机制备的超纯净水。
标准品包括水杨酸（纯度99.5%）、对香豆酸（纯度98%）、丁香酸（纯度98%）、对羟基苯甲酸（纯度> 99.5%）、鞣花酸（纯度96%）、焦儿茶酸（纯度98%）、香草酸（纯度98%）、异阿魏酸（纯度>98%）、咖啡酸（纯度99%）、反式肉桂酸（纯度99%）、芥子酸（纯度98%），购于上海安谱实验科技公司。
1.2仪器与设备
试验主要仪器与设备包括XevoTQ-S三重四极杆质谱联用仪（美国沃特世公司）、AUY220电子天平（日本岛津公司）、R-200旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）、E120H超声仪（德国ELMA公司）、CF16RXⅡ离心机（日立公司）和DMT-2500涡旋振荡器（杭州米欧仪器有限公司）。
1.3试验方法
1.3.1样品前处理
将2g样品放入50mL离心管中，加入20mL提取液[80%甲醇溶液（含1%抗坏血酸）]，经10s涡旋振荡和30min室温下超声提取。重复提取上清液并合并之后定容至50mL，最终经0.22μm滤膜处理得到游离型酚酸制备样品，上机测定。
在50mL离心管中添加2g待测样品和20mL提取液，涡旋振荡10s后用超声波提取30min，将上清液转移至100mL容量瓶中；重复提取1次，合并上清液，旋转蒸发至10mL；将其转移至150mL三角瓶中，加入4mol/L NaOH2mL，密封后在气浴中振荡2h避光水解，用12mol/L HCl调节pH值至2，加入20mL正己烷，振荡20min，去除正己烷层；再以20mL 乙酸乙酯进行两次萃取，合并萃取液，旋转蒸发至干，溶解于10mL（50%甲醇：水溶液），经0.22μm滤膜处理得到游离酯型酚酸制备样品，进行上机测定。
将游离酯型酚酸离心后的残渣加入150mL三角瓶中，然后加入4mol/L NaOH20mL，N2密封隔离，再在黑暗条件下振荡2h，以4mol/L HCl调节pH值至2，加入20mL正己烷并于室温下振荡20min，去除正己烷层，用20mL乙酸乙酯进行两次萃取，合并萃取液，旋转蒸发近干后，将最终产物用10mL50%甲醇溶解，混匀过0.22μm滤膜，制备得到结合型酚酸样品，上机测定。
1.3.2谱条件
本试验选择的谱柱为Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×50.0mm，1.7μm），保护柱为Acquity UPLC BEH C18保护柱（2.1mm×5.0mm，1.7μm）；柱温为30℃，以峰面积外标法定量；流动相A采用0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇，流动相B采用5mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水进行谱条件试验。进样量为2μL。流动相洗脱程序见表1。
179
1.3.3质谱条件
采用电喷雾离子源（ESI ），负离子模式离子扫描
范围为100~2000m/z ；ESI 电离电压为-0.6kV ；离子源温度为150℃；去溶剂温度为600℃；脱溶剂气（N 2）流速为1000L/h ；锥孔气（N 2）流速为50L/h 。
1.4酚酸标准溶液配制
分别称取各酚酸标准品10mg ，用甲醇溶解并定容至10mL ，配制成1mg/mL 的各酚酸标准储备液，然后于-20℃保存。根据试验需要，准确吸取一定量的
各酚酸标准品储备液，用水稀释成适当浓度的酚酸混合标准工作液，现用现配。
1.5数据分析
所有菠萝样品平行测定3次，以干物重计，取平
均值。采用Excel 2010进行数据统计与分析。
2
结果与分析
2.1
谱、质谱条件的优化
谱优化结果表明：当流动相A 为0.1%甲酸乙
腈、流动相B 为0.1%甲酸水时，出峰峰形较好且响应灵敏。本研究选择0.1%甲酸乙腈作为流动相A 、0.1%甲酸水作为流动相B 。
配制1μg/mL 的酚酸混标，在质谱上对其母离子和子离子的锥孔电压和碰撞能量进行优化，确定11种酚酸的定量和定性离子的最优质谱条件，具体质谱参数见表2。各酚酸分离度较好，峰型尖锐，能够满足11种酚酸的分离要求，总离子流图见图1。
2.2线性范围和检出限
在优化的试验条件下，进2μL 酚酸混合标准溶
液样品，浓度为0.1~1.0mg/L 。随着酚酸混合标准溶液浓度的增加，响应值也随之增加，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，计算得出11种酚酸线性工作
曲线，详见表3。回收率和精密度试验数据见表4。
2.3
菠萝样品中酚酸含量的测定
菠萝样品经过前处理，在优化的试验条件下测定
11种酚酸含量。11种酚酸按其碳骨架结构主要有苯甲酸型酚酸，包括水杨酸、对羟基苯甲酸、3，5-二羟基
苯甲酸、丁香酸、香草酸；肉桂酸型酚酸包括咖啡酸、芥子酸、鞣花酸、反式肉桂酸、异阿魏酸、对香豆酸。苯甲酸型酚酸测定结果见表5，肉桂酸型酚酸测定结果见表6。11种酚酸中含量最高的酚酸为异阿魏酸（607.01~1166.82μg/g ）；反式肉桂酸含量也较高，为195.08~294.59μg/g ；其次依次是芥子酸、对香豆酸、咖
啡酸、丁香酸、对羟基苯甲酸、3，5-二羟基苯甲酸、香草酸、鞣花酸和水杨酸。菠萝样品中酚酸含量较为丰表2
11种酚酸的质谱条件名称
水杨酸对羟基苯甲酸3，5-二羟基苯甲酸对香豆酸香草酸咖啡酸异阿魏酸丁香酸芥子酸鞣花酸反式肉桂酸
离子扫描模式
负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子
分子量138137154164168180154158224302148
定量/定性离子对137.0/93.0137.1/93.0153.0/109.0163.0/115.0167.0/108.1179.0/117.0153.1/134.0157.0/167.0223.0/164.0301.0/229.0149.0/131.0
锥孔电压/V
2020252522272020252518
碰撞能量/V
1515151515202025153520
图1酚酸总离子流图
相对响应值/%
100500
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
1.07
1.84
2.442.77
2.91
3.43
3.66
4.03
时间/min
表1
流动相梯度条件
时间/min
0~<0.50
0.50~<5.005.00~<5.105.10~<5.205.20~<6.00
流速/（mL ·min -1
）0.30.30.30.30.3
流动相A
/%
5.0
70.010.05.05.0流动相B /%95.030.090.095.095.0
曲线点66666
180
富，说明菠萝具有较好的营养价值。
按照游离型、游离酯型、结合型分类分别对4个城市的菠萝样品测定结果的均值进行比较，结果见表7。菠萝样品中每种酚酸主要是以游离酯型和结合型存在，游离型较少。只有在对羟基苯甲酸、丁香酸、咖啡酸、芥子酸、反式肉桂酸、异阿魏酸、对香豆酸中有
表311种酚酸的保留时间、线性回归方程、相关系数和检测限
名称
水杨酸
对羟基苯甲酸3，5-二羟基苯甲酸丁香酸
咖啡酸
芥子酸
鞣花酸
异阿魏酸
香草酸
对香豆酸
反式肉桂酸保留时间/min
4.02
2.44
1.85
2.92
2.78
3.43
3.83
3.58
2.76
3.29
4.57
线性回归方程
y=2529.17x+1778.03
y=1527.33x+5631.74
y=2216.75x-1014.52
y=305.838x-640.468
y=2404.88x+3361.92
y=109.889x-390.682
y=36.2839x-131.929
y=71.3232x-78.4037
y=28.5445x+47.2215
y=3149.03x+14297.3
y=79.6435x+374.283
相关系数
0.9997
0.9997
0.9997
0.9997
0.9993
0.9987
0.9996
0.9998
0.9993
0.9997
0.9995
检出限/（mg·kg-1）
0.0009
0.0025
0.0014
0.0092
0.0012
0.0146
0.0858
0.0189
0.1042
0.0010
0.0253
表411种酚酸的回收率与精密度
名称
水杨酸
对羟基苯甲酸3，5-二羟基苯甲酸丁香酸
咖啡酸
芥子酸
鞣花酸
异阿魏酸
香草酸
对香豆酸
反式肉桂酸
1μg/g
70.8~78.4
72.4~75.5
70.5~80.2
71.5~76.4
80.7~83.8
70.9~91.4
70.2~80.5
92.1~97.6
72.4~78.2
70.9~74.8
75.2~79.2
RSD/%
4.28
1.61
4.99
2.48
1.57
10.27
5.59
2.86
2.98
1.95
3.39
50μg/g
72.8~80.9
82.9~92.4
68.9~78.5
70.0~73.5
60.8~80.9
83.5~90.6
72.1~79.9
81.0~88.3
70.0~89.1
70.4~80.6
74.1~76.2
RSD/%
4.25
4.75
5.08
1.82
10.62
3.55
3.95
3.86
9.86
5.10
1.72
500μg/g
70.4~78.6
80.6~82.5
60.5~75.1
70.9~76.4
71.9~73.2
70.4~72.1
71.9~73.6
67.2~80.5
74.1~85.6
76.1~80.9
72.8~80.6
RSD/%
4.22
0.97
7.96
3.02
0.66
0.89
0.62
6.75
6.27
2.74
3.92
表5菠萝样品中苯甲酸型酚酸的含量
单位：（μg·g-1）
采样点
北京重庆武汉广州水杨酸
0.21
0.10
0.13
0.09
对羟基
苯甲酸
7.14
4.57
5.15
5.86
3，5-二羟
基苯甲酸
5.61
3.30
2.08
1.26
丁香酸
49.62
12.84
22.78
13.05
香草酸
4.30
3.80
2.63
2.94
单位：（μg·g-1）
表7菠萝样品中不同类型酚酸的含量
类型
游离型游离酯型结合型总量水杨酸
-
0.07
0.04
0.11
对羟基苯甲酸
0.08
4.62
0.25
4.95
3，5-二羟基苯甲酸
-
2.57
0.06
2.63
丁香酸
0.79
19.57
0.54
20.90
香草酸
-
2.54
0.25
2.79
咖啡酸
2.51
27.99
7.84
38.35
芥子酸
23.56
50.05
3.93
77.54
鞣花酸
-
0.55
0.00
0.55
反式肉桂酸
1.70
44.35
173.76
219.81
异阿魏酸
7.88
224.31
602.30
834.49
对香豆酸
1.15
28.23
31.63
61.01
注：“-”为未检出。
单位：（μg·g-1）表6菠萝样品中肉桂酸型酚酸的含量
采样点
北京
重庆
武汉
广州
咖啡酸
73.25
32.45
39.53
34.43
芥子酸
162.61
27.76
97.58
79.91
鞣花酸
0.99
0.15
0.31
1.30
反式肉
桂酸
204.93
241.15
294.59
195.80
异阿
魏酸
1166.82
931.06
971.74
607.01
对香
豆酸
69.61
57.78
81.26
57.71
游离型存在，其他均未检出。
3结论
本研究利用超高效液相谱-串联质谱法建立了菠萝中11种酚酸含量的测定方法，该方法线性范围宽、检出限低且测定灵敏性高，可有效提高检测效率。菠萝中酚酸主要以游离酯型和结合型存在于菠萝样品中，菠萝中部分酚酸中含有游离型且含量较低。通
（下转第190页）
181
留量进行分析，可在一定程度上解决采用传统方法检测蔬菜农药残留量存在的不足。本研究主要从吸附溶剂、提取方法、固相萃取柱3个方面进行了方法优化，并进行了快速测定。测定结果表明，选用不含GCB 小柱作为吸附剂，采取涡旋混匀提取，选用Card-NH2柱作为固相萃取柱，可准确测定白菜中的农药残留量，检测农药时在浓度范围为1~100ng/mL时线性相关性较好；当加标浓度为0.004mg/kg时，回收率可达到96.23%~116.84%，相对偏差仅为4.34%~8.64%。该方法分离性好、选择性高、操作简单、检测速率较高，在大棚蔬菜农药残留量检测具有较好的应用价值。参考文献
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，
2022
（
17
）
：
buchi
180-183.
（上接第181页）
过对菠萝样品中的酚酸进行定量测定，为评价菠萝的
营养成分和功能活性物质提供了依据，也为探究其他
水果中的酚酸含量提供了参考。
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