目的 探索因子类辅料对蛋白含量检测的影响。方法 将不同含量的因子类辅料添加至人凝血因子Ⅷ样品中，采用中国药典三部中的蛋白含量检测方法（LOWRY法）检测添加辅料与未添加辅料的人凝血因子Ⅷ原液的蛋白含量，同时与凯氏定氮法进行比较，计算辅料的干扰率，以评价其干扰的大小。结果 常用因子类辅料（甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘露醇）在因子类产品中对蛋白含量的干扰率，赖氨酸干扰最小，其次为甘氨酸，干扰最大的是精氨酸和甘露醇。结论 采用LOWRY法显示这4种常用因子类辅料对蛋白含量的干扰并不强烈，但LOWRY法准确快速，操作简单，所以建议在生产过程控制中采用LOWRY法进行蛋白含量的快速检测。
标签：常用因子类辅料；人凝血因子Ⅷ；LOWRY法
随着国内因子类产品的纯度越来越高，随之而来的问题是高纯因子类产品的蛋白含量很低（0.1～2mg/ml），辅料含量却很高。中国药典三部中的第一种蛋白含量检测方法采用凯氏定氮法，但是此法对于低于0.5mg/ml含量蛋白检测的样品检测稳定性较差，而且操作繁琐，耗时较长。为解决此问题，本次研究采用灵敏度高、反应迅速的LOWRY法[1]对因子类产品的蛋白含量检测进行探索，同时采用凯氏定氮法进行对比，观察常用辅料对因子类产品蛋白含量的影
响，以期建立因子类产品蛋白含量的快速检测方法。
1 资料与方法
1.1一般资料 岛津UV-1800紫外-可见分光光度计，BUCHI K-360型蒸馏系统，BUCHI K-439型消化系统，Metrohm877型滴定仪，甘氨酸（天津天安）、赖氨酸（上海味之素）、精氨酸（上海味之素）、甘露醇（北京双鹤），硼酸（成都科龙），硫酸（成都金山），氢氧化钠（成都科龙），钨酸钠（成都科龙）LOWRY法试剂盒（美国BIO-RAD），人凝血因子Ⅷ原液-取自生产过程中，人凝血因子Ⅷ（凯氏定氮法）质控品
1.2方法 LOWRY法本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝化合物，该蓝化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质的含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量[2]。
凯氏定氮法：本法是分析化学中一种常用的确定有机化合物中氮含量的检测方法，根据含氮有机物加浓硫酸经消化后，生成硫酸铵，硫酸铵倍氢氧化钠分解释放出氨，氨被水蒸气蒸馏入硼酸液中生成硼酸铵，最后用强酸滴定，依据强酸消耗量可计算出供试品的含氮量，再乘以6.25得到蛋白含量。
1.3辅料配方 由于不同厂家添加的辅料不同，因此我们主要考察4种主流辅料（甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘露醇[3]）的干扰情况，同时以人凝血因子Ⅷ原液的辅料添加量为例，考虑辅料作为保护剂的最大量（见表1）。通过比较含辅料与不含辅料的蛋白含量的检测结果评价其干扰性。
1.4 LOWRY法标准曲線设计 将标准品（试剂盒自带）分别稀释为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/ml；制作标准曲线，计算直线回归相关系数。
1.5样品检测 本文采用LOWRY法和凯氏定氮法检测两种蛋白浓度溶液的蛋白含量。按照表1中的配方浓度用纯化水配制成辅料溶液，分别用纯化水和各辅料溶液将人凝血因子Ⅷ原液稀释至1.0 mg/ml 和0.2 mg/ml，将2种浓度的样品用LOWRY法试剂盒（BIO-RID试剂）测定3次，用紫外可见分光光度计在650nm处进行OD值测定，并将样品的OD值代入标准曲线中进行线性回归，求得样品的测定值。同时用凯氏定氮法进行对比。
2 结果
2.1标准品的相关性试验结果，试验3次，其相关系数（R2）分别为0.9993、0.9993、0.9990。
buchi说明该方法具有很好的线性相关性，即用该标准品作为标准曲线，所求的回归方程是有意义的。
2.2使用辅料和纯化水作为稀释液稀释人凝血因子Ⅷ原液至1.0mg/ml和0.2 mg/ml两种浓度，采用LOWRY法进行蛋白含量测定，同时比较LOWRY法和凯氏定氮法的RSD值，结果见表2和表3。
3 讨论
试验结果表明，甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘露醇4种辅料均对因子类产品的蛋白含量检测结果有干扰，在1.0mg/ml和0.2mg/ml两种蛋白浓度时，LOWRY法的检测结果表明赖氨酸干扰最小，其次为甘氨酸，干扰最大的是精氨酸和甘露醇。凯氏定氮法的结果显示蛋白含量检测的重复性较差（1.0mg/ml样品浓度时最大RSD值为9%，0.2 mg/ml样品浓度时最大RSD值为22%），且呈现浓度越低重复性越差的趋势，可能为低蛋白浓度接近了凯氏定氮法的检测下限，造成数据波动性较大，影响了这种方法的准确性。而LOWRY法的数据重复性较好（1.0mg/ml和0.2mg/ml样品浓度时最大RSD值均为4%，），且呈现浓度越低干扰率越小的趋势（1.0mg/ml样品浓度时甘露醇最大干扰率14.1%，0.2mg/ml样品浓度时甘露醇最大干扰
率9.1%），同时LOWRY法检测流程较为简单快速，非常适合微量蛋白浓度的检测。所以本人建议在生产过程控制中采用LOWRY法进行蛋白含量的快速检测，以期达到质量控制的目的。
参考文献：
[1]李海玲，彭书明，李凛，等.4种常用蛋白浓度测定方法的比较[J].中国生物药化杂志，2008，04：277-278+282.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典三部[M].中国医药科技出版社，附录34蛋白质测定法（LOWRY法），2010.
[3]郑丽欣.探讨甘氨酸、甘露醇对LOWRY法测蛋白含量的干扰[J].海峡药学，2006，03：81-83.编辑/哈涛
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