产业科技创新 Industrial Technology Innovation
夏雅俊
（兰州石化职业技术学院，甘肃 兰州 730000）
摘要：以油橄榄叶为原料，对其主要有效成分橄榄苦苷和总黄酮的提取工艺进行研究。以浸膏得率、浸膏中橄榄苦苷含量和总黄酮含量为评价指标，选择料液比（即溶剂体积与油橄榄叶质量的比（倍），下同）（A）、提取时间（B）和浸泡时间（C）为考察因素，采用L9（34）正交试验优选油橄榄叶有效成分的最佳提取工艺条件。根据不同的提取目的，选择不同的评价指标会得到不同的提取工艺条件。若以提取橄榄苦苷为目的，其最佳提取工艺为：以10倍量的φ(CH3CH2OH)=60%乙醇溶液(下同)，提取1.5 h，浸泡0 h；若以提取总黄酮为目的，其最佳工艺为：以6倍量60%乙醇溶液，提取2 h，浸泡1 h；若对三个指标采用加权分析，以综合评分为考察指标时，得到的最佳工艺条件为：以6倍量60%乙醇溶液，提取2 h，浸泡1 h。上述优选工艺条件可为工业化生产提供参考。
关键词：油橄榄叶；有效成分；提取工艺；正交试验
中图分类号：TQ461 文献标识码：A 文章编号：2096-6164（2020）19-0034-05
油橄榄叶为木犀科（Oleaceae）木犀榄属（Olea）植物油橄榄（Olea europaea L.）的叶，其化学成分主要有橄榄苦苷、黄酮、游离醇、甾醇、烷烃、多酚等物质[1-8]。研究表明，油橄榄叶提取物具有抗氧化、抗真菌、降血压、降血脂等活性[7-9]。化物所天然产物重点实验室[3,8-12]近年来系统开展油橄榄叶化学成分、抗氧化活性、抗糖尿病活性、分析方法等研究。其中关于油橄榄叶抗糖尿病活性研究表明：橄榄苦苷和黄酮类化合物是油橄榄叶抗糖尿病活性的物质基础。关于油橄榄叶中提取总黄酮和橄榄苦苷的研究已有报道。如梁剑等[13]利用正交实验优选油橄榄叶中的总黄酮提取工艺，但其仅以总黄酮单一指标评价提取工艺，没有涉及到浸膏得率以及橄榄苦苷的提取。叶建中等[14]采用超声辅助提取技术对油橄榄叶中的橄榄苦苷及羟基酪醇进行提取方法的研究；而朱静平[15]仅以多酚类物质提取率为评价指标，以焦性没食子酸为对照品，通过乙醇浓度、提取料液比、提取时间、提取温度4因素，先通过单因素试验，然后采用正交试验优选提取工艺条件。李辰等[16]研究油橄榄叶乙醇提取物利用大孔吸附树脂技术同步分离制备高纯度橄榄苦苷和总黄酮的工艺技术，但没有系统研究从油橄榄叶中提取橄榄苦苷和总黄酮的工艺条件。
文章以浸膏得率、浸膏中橄榄苦苷含量和总黄酮含量为评价指标，通过单因素实验和正交实验，优选乙醇回流同时提取油橄榄叶中抗糖尿病有效成分橄榄苦甘和总黄酮提取工艺条件，为研发以油橄榄叶为原料的中药新药提供技术参考。
1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料
1.1.1 试剂与材料
油橄榄叶采自甘肃省陇南市，经中国科学院兰州化学物理研究所戚欢阳副研究员鉴定为木樨榄属植物油橄榄Olea europaea L.的叶。酒精（工业纯，甘肃黄羊镇糖厂）；甲醇（谱纯，批号：20120818063，山东禹王集团）；乙醇（φ(CH
3
CH
2
OH)=95%）（分析纯，批号：130104，四川西陇化工有限公司）；无水三氯化铝（分析纯，批号：120302，天津市丰越化学品有限公司）；芦丁（中药对照品，纯度不低于96%，批号：MUST-13082002，中国科学院成都生物研究所成都曼思特生物科技有限公司）；橄榄苦苷对照品由中科院西北特植物资源化学重点实验室从油橄榄叶乙醇提取部位，通过硅胶柱谱、重结晶等分离纯化手段分离
得到，经13C-NMR、1H-NMR 结构鉴定并与相关文献对照[3]，HPLC 峰面积归一化法测定其纯度不低于95%。
1.1.2 仪器
Agilent 1200 Pump, Agilent 1200真空在线脱气机，Agilent 1 200 DAD检测器，Agilent 1 200 Workstation, Sinochrom ODS-BP柱（250×4.6 mm，
作者简介：夏雅俊（1988- ），女，湖北荆门人，硕士研究生，助教，主要从事化学、分析化学教学等方面研究。〈技术应用〉
35第2卷 第19期
5 μm，批号：080606，柱号：E2319200，大连依利
特分析仪器有限公司）；0.45 μm针筒过滤器；电子
天平（Sartorius BT224S，Max=220 g，d=0.1 mg，
北京赛多利斯仪器有限公司）；PTHW型调温电热套（巩
义市英裕予华仪器厂）；DZTU型调温电热套（北京永
光明医疗仪器厂）；SHZ-DⅢ循环水真空泵（郑州市亚
荣仪器有限公司）；R-3型旋转蒸发仪（BUCHI公司，
瑞士）；303-3电热保温箱（上海阳光实验仪器有限公
司）；DZF-6050型真空干燥箱（巩义市英裕予华仪器
厂）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（江苏省昆山市
超声仪器有限公司）；T6新世纪紫外-可见分光光度
计（北京普析通用仪器有限责任公司）。
1.2 评价指标测定方法
1.2.1 浸膏得率测定
称取阴干的油橄榄叶30 g置于圆底烧瓶中，加
入一定量的提取溶剂，加热回流提取，将提取液过滤，
滤液用旋转蒸发仪浓缩（T=50℃～55℃，压力为-0.08
MPa），浓缩液移入100 mL容量瓶中，放至室温后定容。
摇匀后精密量取样品浓缩溶液25 mL，至于已恒重的
表面皿中，在90℃干燥箱中放置6 h，取出后放置于
真空干燥箱中70℃恒重3 h后，取出表面皿置于干燥
器中冷却0.5 h，迅速称重，按照下列计算公式计算
不同溶剂提取的浸膏得率
：
（M
1为浸膏质量，单位：g；M
2
为
样品质量，单位：g）
1.2.2 总黄酮含量测定
（1）样品溶液制备
精密称取一定质量1.2.1项下得到的干浸膏，置于25 mL容量瓶中，加入60%乙醇近刻度，超声15 min（30℃，125 W）使其完全溶解，放置室温后用60%乙醇定容，摇匀、备用。
（2）对照品溶液制备
精密称取一定的芦丁对照品，置于25 mL容量瓶中，首先移取2.5 mL纯净水于容量瓶中，再加入60%分析纯乙醇近刻度线，在30℃下，超声15 min（30℃，功率为125 W）使其完全溶解，放置室温后用60%乙醇定容，摇匀，得对照品储备液。各准确量取一定量储备液至10 mL 容量瓶中，定容，得到系列浓度的对照品溶液。
（3）浸膏中总黄酮含量测定
分别量取对照品溶液和样品溶液，参照文献[12]在紫外-可见分光光度计下，以415 nm处检测分析（1）和（2）项下的样品溶液和对照品溶液。对照品溶液所得线性方程、线性范围、相关系数见表1，并按照
下式计算浸膏中总黄酮含量：（C 为测试样品溶液中总黄酮含量，单位：mg·mL-1；M为
称取的干浸膏质量，单位：g）
1.2.3 浸膏中橄榄苦苷含量测定[17]
（1）样品溶液制备
精密称取一定质量1.2.1项下得到的干浸膏，加
入甲醇至近刻度，超声0.5 h（30℃，125 W），取出
静置至室温，然后用甲醇定容，摇匀、备用。
（2）对照品溶液制备
精密称取一定量的橄榄苦苷对照品，加入甲醇至
近刻度，超声0.5 h（30℃，125 W），取出静置至室温，
然后用甲醇定容，摇匀，得对照品储备溶液。各准确
量取一定量储备液以甲醇定容至10 mL 容量瓶中，得
到系列浓度的对照品溶液。
（3）谱条件
检测波长：230 nm；流速：1.000 mL·min-1；柱温：
30℃；进样量：10 μL；流动相：V（水）（A）：V（甲醇）
（B），梯度洗脱：0 min～5 min，30%B；5 min～20
min，30%～52%B；20 min～25 min，52%～50%B。
（4）橄榄苦苷含量测定
在（3）的谱条件下，分别将（1）下的样品溶
液和（2）下的对照品溶液进样分析，进样前溶液用0.45
μm微孔滤膜过滤，取滤液进样分析。对照品溶液所
得线性方程、线性范围、相关系数见表1，并按照下
式计算对干浸膏中橄榄苦苷含量
：
（C为测试样品溶液中含量浓度，单位：μg·mL-1，M为称取的干浸膏质量，单位：g）
表1 对照品溶液的线性关系
对照品回归方程线性范围相关系数(R2)芦丁y=0.0307x-0.0003
0.007 84～0.023
52(mg·mL-1)
0.999 9
橄榄苦
苷
y=8.5042x-105.72
14.21～3
552.5(μg·mL-1)
0.999 9
注：芦丁标准曲线中，x代表吸光度值，y代表
芦丁对照品浓度（mg·mL-1）；橄榄苦苷标准曲线中，
x代表对照品浓度（μg·mL-1），y代表峰面积。
2 结果与讨论
2.1 提取溶剂的选择
分别称取阴干的油橄榄叶30 g，第1次分别加入
12倍量的水和60%乙醇溶液，回流提取1 h（按沸腾
计时），第2次分别加入10倍量的水和60%乙醇溶液，
同法提取。合并2次提取液，过滤，滤液用旋转蒸发
仪浓缩（50℃~55℃，-0.08 MPa），按照1.2项分别
测定其浸膏得率、浸膏中总黄酮和橄榄苦苷含量，结
夏雅俊：油橄榄叶中有效成分提取工艺研究
产业科技创新 Industrial Technology Innovation
36Vol.2 No.19果见表2。由表2可知，以浸膏得率、浸膏中总黄酮
以及橄榄苦苷含量作为评价指标时，选择60%乙醇为
提取溶剂更优。
表2 提取溶剂的选择
溶剂类型浸膏得率/%浸膏中总黄酮含
量/%
浸膏中橄榄苦苷含量
/%
水20.02 2.2310.94
60%乙醇32.30 5.7714.98
2.2 提取次数的选择
称取阴干的油橄榄叶30 g，第1次加入12倍量的60%乙醇溶液，回流提取1 h（按沸腾计时），第2次和第3次加入10倍量的60%乙醇溶液，同法提取。将1、2次提取液合并、过滤、浓缩，第3次提取液过滤、浓缩，分别按照1.2项测定其浸膏得率、浸膏中总黄酮以及橄榄苦苷含量，结果见表3。由表3可知：以
浸膏得率为评价指标时，第3次提取所占比例为5.08%；以总黄酮和橄榄苦苷含量为考察指标时，第3次醇提所占比例分别为6.13%和5.32%；表明第1、2次醇提已基本完全，故采用醇提2次的工艺。
表3 提取次数的选择
溶剂类型浸膏得率/%
浸膏中总黄酮含
量/%
浸膏中橄榄苦苷
含量/%
前两次合并液32.30 5.7716.40
第3次提取液 1.730.3770.929
第3次所占比例
/% 5.08 6.13 5.36 2.3 正交实验优化提取工艺
按照表4因素水平表设计正交实验。
表4 正交实验因素水平表
水平
因素
A加醇量/倍B提取时间/h C浸泡时间/h 110 2.00
28 1.50.5
36 1.01
由于加醇量、提取时间以及浸泡时间等因素对提取效率有较显著的影响，为了考察这3个因素对浸膏得率、总黄酮以及橄榄苦苷含量的综合影响，选择这3个因素进行正交实验。称取阴干的油橄榄叶30 g，
表5 正交实验设计表及结果（n=3）
试验号
因素评价指标
A B C D浸膏得率/%
浸膏中总黄酮含量
/%
浸膏中橄榄苦苷含
量/%
综合评分
1111130.40 4.2916.4392.21 2122228.88 4.1916.6591.00 3133329.85 4.2216.2590.88 4212331.88 4.7514.8092.84 5223132.07 4.9114.8294.27 6231231.52 4.6915.2793.11 7313231.12 5.0814.5394.31 8321331.31 4.9614.7894.22 9332129.97 4.9114.4191.97
浸膏得率k
1
29.7131.1331.15---
CT=T2/9
=8538.38 k
2
31.8230.8230.24---
k
3
30.8730.4531.01---
R 2.110.690.90---
SS 6.720.709 1.43---
总黄酮k
1
4.23 4.71 4.64---
CT=T2/9
=195.81 k
2
4.78 4.69 4.62---
k
3
4.98 4.60 4.74---
R0.750.110.12---
SS0.9000.01930.0243---
橄榄苦苷k
1
16.4415.2515.49---
CT=T2/9
=2114.16 k
2
14.9615.4215.29---
k
3
14.5715.3115.20---
R 1.870.160.29---
SS 5.840.04130.136---
综合评分k
1
91.3793.1293.18---
CT=T2/9
=77435.43 k
2
93.4193.1691.94---
k
3
93.5091.9993.15---
R 2.14 1.17 1.24---
SS8.738 2.660 3.028---
37第2卷 第19期
第1次加入12倍量的60%乙醇溶液，浸泡一定时间后，回流提取1 h（按沸腾计时），第2次加入10倍量的60%乙醇溶液，同法提取。将1、2次提取液合并、过滤、浓缩，分别按照1.2项测定其浸膏得率、浸膏中总黄酮和橄榄苦苷含量，结果见表5。
注：综合评分=浸膏得率评分+总黄酮含量评分+橄榄苦甘含量评分；其中：浸膏得率评分=权重系数（20）×浸膏得率/最大浸膏得率; 总黄酮含量评分=权重系数（40）×总黄酮含量/最大总黄酮含量；橄榄苦甘含量评分=权重系数（40）×橄榄苦甘含量/最大橄榄苦甘含量。
将表5中的正交实验结果进行方差分析，结果见表6。
注：*F
0.05
(2,2)=19.00; **F
0.01
(2,2)=99.00
根据不同的提取目的选择不同的评价指标分析得到下面二种提取工艺条件：
如果以提取橄榄苦苷为目的，以其提取率作为为评价指标时，由表5中极差R值大小显示，各因素的主次顺序为A＞C＞B；通过SPSS软件分析，由表6的方差分析结果表明：A 具有显著性影响（P＜0.05）、B、C两个因素均没有显著性意义（P＞0.05），以
A
1
B
2
C
1
为最佳条件，即以10倍量的60%乙醇溶液，提取1.5 h，浸泡0 h。
如果以提取总黄酮为目的，以其提取率为评价指标，由表5中极差R值大小显示，各因素的主次顺序为A＞C＞B，其中A因素具有极显著性意义（P
表6 正交实验方差分析
-误差来源SS f S F P
浸膏
A 6.7212 3.36013.469＞0.05 B0.70920.355 1.421＞0.05 C 1.42720.713 2.860＞0.05误差0.5020.25--
总黄酮
A0.90020.450150.83＜0.01** B0.01920.010 2.833＞0.05 C0.02420.012 3.833＞0.05误差0.00720.004--
橄榄苦苷
A 5.8392 2.92050.774＜0.05* B0.04120.0210.357＞0.05 C0.13620.068 1.183＞0.05误差0.1220.06--
综合评分
A8.7382 4.369159.073＜0.01**
B 2.6602 1.33048.564＜0.05*
C 3.0282 1.51455.036＜0.05*误差0.0620.03--
＜0.01），B和C对总黄酮含量的影响不显著（P＞
0.05），以A
3B
1
C
3
buchi为最佳，即以6倍量60%乙醇溶液，
提取2 h，浸泡1 h。
如果以综合提取为目的，则以浸膏得率、总黄酮含量和橄榄苦甘含量通过加权分析得综合指标，由表5中的极差R值大小显示，各因素的主次顺序为A＞C＞B；通过SPSS软件分析，由表6的方差分析结果表明：A具有极显著性意义（P＜0.01），B、C具有
显著性意义，同样得到以A
3B
1
C
3
为最佳的工艺条件。
3 结语
（1）前期的研究表明，油橄榄叶中抗糖尿病的物质基础主要是橄榄苦苷和总黄酮，因此，本文分别以
浸膏得率、总黄酮含量以及橄榄苦甘含量为评价指标进行工艺条件优选，认为通过上述3个评价指标的加权分析得综合指标进行工艺优选更具有意义。
（2）有报道表明，60%乙醇溶液在提取天然产物中黄酮类化合物时，可同时兼顾提取黄酮苷和黄酮苷元。由于考虑到油橄榄叶中黄酮类化合物既有黄酮苷又有黄酮苷元，同时，橄榄苦苷是中极性化合物，在考察提取溶剂时，为了兼顾黄酮苷、黄酮苷元和橄榄苦苷同时能够最大限度提取出来，故在考察乙醇溶液为提取溶剂时，仅考察60%乙醇溶液为提取溶剂。
（3）目前，对油橄榄的开发利用主要集中在油橄榄鲜果加工橄榄油方面，而对其叶的利用很不充分，导致大部分油橄榄叶废弃，这样不仅污染环境，也是资源的浪费。大量研究表明，油橄榄叶中含有生物活
夏雅俊：油橄榄叶中有效成分提取工艺研究
产业科技创新 Industrial Technology Innovation
38Vol.2 No.19
性成分，开发利用使之产业化，其市场前景广阔。
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