gentleMACS™ 操作步骤
1.背景信息
在许多实验中，需要用到单细胞悬液，如用MACS®技术分选细胞时，要想获得高纯度和回收率的话，单细胞悬液就很重要。德国美天旎生物技术有限公司开发的gentleMACS™ 分离器能够提供优化的程序，用于从不同的组织中获取单细胞悬液。这些组织包括小鼠脾脏，肝脏，肺脏，脑组织等。使用C管，能够在一个密闭的系统中进行全自动的组织分离，可以保证组织操作的无菌，以及能够同时处理2个组织样本。
2. 分离小鼠脾脏的操作步骤
2.1 需要的试剂和仪器
● gentleMACS 分离器
● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)
● 细胞滤器，如30 μm n尼龙滤网（ Pre-Separation Filters# 130-041-407)
● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)
2.2 步骤
▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。
▲ 一只小鼠脾脏的重量约为 80–120 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄).
1. 将小鼠脾脏转移到gentleMACS C 管中，按照脾脏的数量加入缓冲液:
1–2 个小鼠脾脏: 3 mL
3–4个小鼠脾脏: 6 mL
5–6 个小鼠脾脏: 9 mL
2. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上
▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域
3. 开机，选择合适的分离程序：
1–2 个小鼠脾脏: m_spleen_01.
3–6个小鼠脾脏: m_spleen_04.
4. 运行 gentleMACS 程序 m_spleen_01. 或 m_spleen_04.
5. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管
6. (可选) 以 300×g 室温下离心2分钟。
7. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个预分选滤器（1-2个脾脏），该预分选滤器放置于15mL管子中。或者将细胞悬液通过一个细胞过滤网（3-6个小鼠脾脏），该滤网放置于50mL试管中。
8.用5 mL 缓冲液洗涤预分选滤器（Pre-Separation Filter）或者细胞滤器
9. 弃去预选滤器或细胞滤器，室温下以300g离心10分钟，完全去上清。
10.用合适体积的缓冲液重悬细胞，用于后续应用。
3.用胶原酶分离小鼠脾脏的操作步骤
3.1需要的仪器和试剂
● gentleMACS 分离器
● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)
● 细胞滤器，如30 μm n尼龙滤网（ Pre-Separation Filters# 130-041-407)
● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)，4度保存。
● HEPES缓冲液：10mM HEPES-NaOH pH7.4,150mM NaCl,5mM KCl, 1mM MgCl2, 1.8mM CaCl2.
● 胶原酶D溶液：用HEPES液配置终浓度为100mg/mL的胶原酶D溶液。
● DNase I溶液：准备终浓度为20000U/mL的DNase I溶液
3.2 步骤
▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。
▲ 一只小鼠脾脏的重量约为 80–120 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄).
1. 将1-2个小鼠脾脏转移到gentleMACS C 管中，在C管中加入4.9mL HEPES缓冲液，同时加入100uL胶原酶D溶液（终浓度为2mg/mL）
2. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上
▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域
3. 开机，选择合适的分离程序: m_spleen_02.
4. 运行 gentleMACS 程序 m_spleen_02.
5. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管
6. 37°C孵育30分钟
7. 在C管中加入12.5-25uL的DNaseI溶液（终浓度为50-100U/mL）
8. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上
9. 选择和运行 gentleMACS 程序 m_spleen_03.
10. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管
11. (可选) 以 300×g 室温下短暂离心。
12. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个预分选滤器，该预分选滤器放置于15mL管子中。
13.用5 mL HEPES缓冲液洗涤预分选滤器（Pre-Separation Filter）或者细胞滤器
14. 弃去预选滤器或细胞滤器，室温下以300g离心10分钟，完全去上清。
15.用合适体积的缓冲液重悬细胞，用于后续应用。
4.用胶原酶分离小鼠肺组织的操作步骤
4.1需要的仪器和试剂
● gentleMACS 分离器
● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)
● MACSmix 试管混悬器（# 130-093-753)
● 细胞过滤网，70 μm筛网
● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)，4度保存。
● HEPES缓冲液：10mM HEPES-NaOH pH7.4,150mM NaCl,5mM KCl, 1mM MgCl2, 1.8mM CaCl2.
● 胶原酶D溶液：用HEPES液配置终浓度为100mg/mL的胶原酶D溶液。
● DNase I溶液：准备终浓度为20000U/mL的DNase I溶液
4.2 步骤
▲ 如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。
▲ 一只小鼠脾脏的重量约为 110–150 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄).
1.在一个含有PBS(ph7.2)的培养皿中解剖小鼠肺组织并清洗之。
注:确保从小鼠肺组织中去除胸腺，心肌，输出神经，血管，气管，结缔组织等。
2. 将1个小鼠肺，最多3个小鼠肺组织转移到gentleMACS C 管中，在C管中加入4.9mL HEPES缓冲液，同时加入100uL胶原酶一块操D溶液（终浓度为2mg/mL），以及10uL DNase I溶液（1个小鼠肺组织）或者20uL DNase I溶液（2-3个肺组织）（DNase I终浓度：1个肺：40U/mL;2-3个肺：80U/mL）
3. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上
▲ 注意: 必须确保组织块在转子区域
4. 开机，选择合适的分离程序: m_lung_01.
5. 运行 gentleMACS 程序 m_lung_01.
6. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管
7. 将C管放置在MACSmix试管旋转仪上，37°C孵育30分钟。或者每隔5分钟，手工摇匀C管，重悬沉淀的组织块。
8. 反应结束后，将C管倒置在gentleMACS 分离器上
9. 选择和运行 gentleMACS 程序 m_lung_02.
10. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管
11. (可选) 以 300×g 室温下短暂离心。
12. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个70 μm的细胞过滤网，该过滤网放置于50mL管子中。
13.用5 mL HEPES缓冲液洗涤预分选滤器（Pre-Separation Filter）或者细胞滤器
14. 弃去预选滤器或细胞滤器，室温下以300g离心10分钟，完全去上清。
15.用合适体积的缓冲液重悬细胞，用于后续应用。
5.用胶原酶IV分离小鼠肝脏的操作步骤
5.1需要的仪器和试剂
● gentleMACS 分离器
● gentleMACS C 管 (# 130-093-237)
● MACSmix 试管混悬器（# 130-093-753)、
● 红细胞裂解液（130-094-183）
● 细胞过滤网，70 μm筛网
● 缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)，4度保存。
● HEPES缓冲液：10mM HEPES-NaOH pH7.4,150mM NaCl,5mM KCl, 1mM MgCl2, 1.8mM CaCl2.
● 胶原酶IV溶液：用KRB溶液制备含5000U的胶原酶IV溶液。（如胶原酶IV C5138,Sigma-Aldrich）