自己想了一个大片段的连接载体方法，也不知道行不行，供大家参考一下。
宋  健
如果你的目的基因内部接近中间的部分有一个合适的酶切位点（载体上面没有），比如说SpeI。
一、 根据载体上面的酶切位点，设计引物，扩增起始区到SpeI位点之间的片段，扩增片段两端加入载体上面的酶切位点。
二、用BamHI和KpnI双酶切载体和回收的片段，连接。
经典片段
三、扩增第二段序列加入KpnI酶切位点。
四、用KpnI和SpeI双酶切载体和片段，连接。