严宪才吴志光刘锦文周耀辉刘俊锋陈子良（中山市中医院急诊科，中山528400）
中图分类号R446.11文献标志码A文章编号1000-484X（2021）07-0850-06
［摘要］目的：探究miR-10a、miR-21联合预测老年重症脓毒症患者28d病死率的价值。方法：回顾102例老年重症脓毒症患者的资料，根据预后情况分为死亡组和存活组。比较2组入院时外周血miR-10a、miR-21，分析死亡的影响因素、
APACHEⅡ评分与外周血miR-10a、miR-21的相关性及miR-10a、miR-21联合预测患者病死的效能。结果：28d病死率为28.43%；死亡组外周血miR-10a、miR-21表达水平显著高于存活组（P<0.05）；APACHEⅡ评分≥20分、CRP≥40mg/ml、血清乳酸≥3mmol/L、外周血miR-10a表达水平≥1.31、外周血miR-21表达水平≥2.39是老年重症脓毒症患者28d病死的独立危险因素，VitD>26ng/ml是其保护因素；APACHⅡ评分与外周血miR-10a、miR-21无相关性（P>0.05）；外周血miR-10a联合miR-21预测老年重症脓毒症患者28d病死率的特异度、AUC均高于单独预测。结论：老年重症脓毒症患者28d内病死率高，需根据影响因素加强防控，外周血miR-10a联合miR-21有理想的预测效能。
［关键词］重症脓毒症；病死率；微小核糖核酸-10a；微小核糖核酸-21
Combination of miR-10a and miR-21to predict mortality of elderly patients with severe sepsis
YAN Xian-Cai，WU Zhi-Guang，LIU Jin-Wen，ZHOU Yao-Hui，LIU Jun-Feng，CHEN Zi-Liang.Emergency Depart⁃ment of Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhongshan528400，China
［Abstract］Objective：To investigate the combination of miR-10a and miR-21to predict the in28d mortality of elderly pa‐tients with severe sepsis.Methods：The data of102elderly patients with severe sepsis were retrospectively analyzed，who were divided into death group and survival group according to the prognosis.The expression levels of miR-10a and miR-21in peripheral blood at ad‐mission were compared between the two groups.Analysis the APACHEⅡscores and peripheral blood miR-10a，the correlation of miR-21and miR-10a，miR-21patients with combined forecasting the efficiency of the die.Results：The28d case-fatality rate was 28.43%.At admission，the expression levels of miR-10a and miR-21in the death group were higher than those of the survival group （P<0.05）.APACHEⅡscoring20points or more，CRP acuity40mg/ml，serum lactic acid or3mmol/L，peripheral blood miR-10a expression level1.31or higher，peripheral blood miR-21expression level2.39or higher is the tendency for the old patients with severe sepsis independent risk factors of28d died，VitD>26ng/ml，blood glucose control was a protective factor.ApacheⅡscore
had no correlation with peripheral blood mir-10a and miR-21（P>0.05）.The specificity and AUC of peripheral blood mir-10a combined with miR-21in predicting28d mortality of elderly patients with severe sepsis were higher than those predicted separately.Conclusion：The mortality of the elderly patients with severe sepsis is high with in28d，so it is necessary to strengthen the prevention and control ac‐cording to the influencing factors.
［Key words］Severe sepsis；Mortality；Microribonucleic acid-10a；Microribonucleic acid-21
脓毒症是指有明确感染的全身炎症反应综合征，发病率较高，且以每年1.5%~8.0%的速度增长，病死率在37.4%~46.5%［1］。重症脓毒症表现为伴有器官功能障碍和/或组织灌注不足，若病情短期内得不到有效逆转，患者最终会因多脏器功能障碍死亡［2］。老年人机体功能退化，免疫力降低，抵御疾病能力较弱，老年重度脓毒病患者28d病死率相对较高［3］。因此寻预测老年重度脓毒病患者28d 病死风险的生物标志物，提前调整方案，对降低患者病死率意义重大。微小RNA（microRNA，miRNA）已被证实与人体组织的代谢、炎症反应以及脓毒症的发生发展有着不可分割的联系［4］。微小RNA-10a（microRNA-10a，miR-10a）作为miRNA中
的重要类型，参与炎症、免疫应答反应等多种生物学过程［5］。微小RNA-21（microRNA-21，miR-21）据报道是一种抗凋亡因子，与脓毒症的急性肾损伤有关，影响患者生存期［6］。但miR-10a、miR-21在28d 病死与生存的老年重症脓毒症患者中的表达差异
doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2021.07.015
作者简介：严宪才，男，副主任医师，主要从事内科工作，E-mail：huni643@163。
和其预测价值尚不清楚，因此本研究通过对比研究老年重症脓毒症患者外周血miR-10a、miR-21水平与老年重症脓毒症患者28d病死率之间的关系，探究二者联合对老年重症脓毒症患者28d病死率的预测效能。
1资料与方法
1.1资料
1.1.1一般资料回顾分析2017年6月至2019年10月于本院接受的102例老年重症脓毒症患者的临床资料，其中男性55例，女性47例，年龄60~78岁，平均年龄（63.12±11.04）岁，身体质量指数（body mass index，BMI）15.26~27.65kg/m2，平均BMI （21.66±3.85）kg/m2。措施：血管活性物质干预24例，体外肺膜支持20例，连续性血液净化35例，机械通气辅助通气27例，使用糖皮质激素19例。原发感染部位：肺或呼吸道感染20例，泌尿系统感染26例，腹腔感染10例，中枢系统感染9例，血液感染25例，外科伤口感染5例，胆道感染7例。合并症：合并糖尿病15例，高血压24例，心肌损伤10例，烧伤4例，肝损伤10例，其中合并2项及以上7例。
1.1.2纳入标准①具有明确的感染，临床症状和化验结果均符合脓毒症的诊断标准［7］；②合并出现器官功能障碍如：严重急性呼吸综合征（acute re‐spiratory distress syndrome，ARDS）、心功能不全、应激性溃疡、急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）、肝功能不全等；③年龄≥60岁；④临床资料完整并同意调阅研究。
1.1.3排除标准①处于濒死状态；②非细菌感染；③器官移植、非获得性免疫缺陷症、恶性肿瘤；④肝脏、肾脏、心脏疾病处于终末期；⑤妊娠或哺乳。1.2方法
1.2.1分组患者确诊后28d内是否死亡为标准，将102例纳入标准的研究对象分为2组，其中确诊后28d内死亡患者为死亡组，确诊后28d未发生死亡的患者为生存组。
1.2.2检测外周血miR-10a、miR-21所有患者于入院当天采取清晨空腹外周静脉血6ml置于含有肝素无菌抗凝管（20U/ml），密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞，使用RNA提取试剂盒提取外周血单个核细胞中总RNA，利用UV-5800H型紫外分光光度计检测总RNA纯度，采用逆转录试剂盒将总RNA转录为模板链cDNA。采用CFX96型荧光定量PCR仪进行qRT-PCR，反应体系共10μl：miS‐cript SYBR®Green Mix5μl，cDNA（50ng/μl）1μl，上下游引物（10μmol/L）各0.5μl，ddH2O3.0μl。反应条件：95℃90s，95℃30s，63℃30s，72℃15s，45个循环，每个样品均设3个平行反应。采用2-∆∆Ct 法对血清miR-10a、miR-21表达水平进行定量分析。miR-10a、miR-21及内参U6的引物序列见表1。
1.2.3影响老年重症脓毒症患者28d病死率的危险因素分析将所有可能影响老人重症脓毒症患者确诊后28d内死亡的影响因素归纳整理：性别、BMI、C反应蛋白（C-reaction protein，CRP）、血清乳酸、急性生理学和慢性健康状况评分系统Ⅱ评分［8］（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ）、维生素D（vitamin，VitD）、措施、原发病、合并症、miR-10a、miR-21，将其作为自变量（X）并赋值，赋值结果见表2，确诊后28d内发生死亡记为1，未发生死亡记为0，分析影响老年重症脓毒症患者28d病死率的危险因素。
1.2.4观察指标①分析影响老年重症脓毒症患者28d内死亡的影响因素及比值比（OR）；②评估miR-10a、miR-21对老年重症脓毒症患者28d内死亡的预测价值。
1.3统计学方法采用统计学软件SPSS20.0进行数据分析，计数资料采用“例/率”表示，行χ2检验，若理论频数在1~5之间，采用校正χ2检验；计量资料采用xˉ±s表示，行t检验；Logistic回归分析影响老年重症脓毒症患者28d病死的危险因素；Pearson法分析患者APACHEⅡ评分与外周血miR-10a和miR-21的相关性；受试者工作特征ROC曲线评估外周血miR-10a和miR-21表达水平预测老年重症脓毒症患者28d病死率的效能。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.12组患者外周血miR-10a、miR-21表达水平比较所有研究对象确诊后28d内死亡患者29例（死亡组）
，存活患者73例（存活组），28d病死率为表1qRT-PCR引物序列
Tab.1Primer sequences of qRT-PCR
Names
miR-10a
miR-21
U6
Primer（5′-3′）
F：GGAGGGGTACCAGAATCCCATTTTGGCCA
R：GGAGGAAGCTTGCGGAGTGTTTATGTCAACT
F：TAGTTATCAGACTGATGTTGA
R：ACAACATCAGTCTTGATAACTA
F：CTCGCTTCGGCAGCACA
R：AACGCTTCACGAATTTGCGT
28.43%。入院时死亡组外周血miR-10a、miR-21表达水平显著高于存活组（P<0.05），见表3。
2.22组不同临床特征患者28d死亡率对比死亡组APACHEⅡ评分≥20分患者构成比显著高于存活组（P<0.05），2组患者在CRP、血清乳酸、VitD水平和外周血miR-10a、miR-21表达水平分布上有差异（P<0.05），其中死亡组CRP≥40mg/L、血清乳酸≥3mmol/L、VitD<20ng/ml、miR-10a表达水平≥1.31、miR-21表达水平≥2.39者构成比显著高于存活组（P<0.05），见表4。2.3Logistic回归分析经过Logistic回归分析可知，APACHEⅡ评分≥20分、CRP≥40mg/ml、血清乳酸≥3mmol/L、外周血miR-10a表达水平≥1.31、外周血miR-21表达水平≥2.39是老年重症脓毒症患者28d病死的独立危险因素（OR=5.842、4.328、
3.554、1.645、
4.031），VitD>26ng/ml是老年重症脓毒症28d病死的保护因素（OR=0.321），见表5。
2.4APACHEⅡ评分与外周血miR-10a、miR-21的相关性分析Pearson分析发现，APACHEⅡ评分与外周血miR-10a、miR-21无相关性（r=0.317、0.309，P=0.085、0.142）。
2.5miR-10a、miR-21及联合对老年重症脓毒症患者28d死亡率的预测价值根据外周血miR-10a、miR-21表达水平及二者联合预测老年重症脓毒症患者28d病死率的ROC曲线（图1）可知，外周血miR-10a、miR-21表达水平的最佳截断点为1.68、1.81，灵敏度分别为9
3.10%、82.75%、96.55%，特异度分别为73.97%、8
4.93%、90.41%，AUC分别为0.863、0.893、0.920，见表6。
表32组外周血miR-10a、miR-21表达水平比较（xˉ±s）Tab.3Comparison of expression levels of miR-10a and miR-21in peripheral blood between two groups
（xˉ±s）
Groups Death group Survial group
t
P n
29
73
-
-
miR-10a
1.88±0.12
1.59±0.13
10.380
0.000
miR-21
3.69±0.45
1.42±0.27
31.297
0.000
表2老年重症脓毒症患者28d病死率自变量赋值表
Tab.2Independent variable assignment of mortality rate in28d in elderly patients with severe sepsis
Independent variable
Gender（X1）
BMI（X2）
CRP（X3）
Serum lactate（X4）
APACHEⅡscore（X5）
VitD（X6）
Intervention of vasoactive drugs（X7）Mechanical ventilation assisted ventilation（X8）
Glucocorticoid（X9）Extracorporeal pulmonary membrane support（X10）
Assignment
Male=0，Female=1
18.5kg/m2~24.9kg/m2=0，
<18.5kg/m2=1，
>24.9kg/m2=2
20mg/L~40mg/L=0
≥40mg/L=1
2mmol/L~3mmol/L=0
≥3mmol/L=1
<20=0
≥20=1
26ng/mL~65ng/mL=0
<26ng/mL=1
No=0，Yes=1
No=0，Yes=1
No=0，Yes=1
No=0，Yes=1
Independent variable
Continuous blood purification（X11）
Primary infection site（X12）
Diabetes mellitus（X13）
Hypertension（X14）
Myocardial injury（X16）
Burn（X17）
Liver injury（X18）
2or more complications（X19）
miR-10a［9］（X20）
miR-21［10］（X21）
Assignment
Yes=0，No=1
Pulmonary infection=0，
Urinary tract infection=1，
Celiac infection=2，
Infection of central system=3，
Blood infection=4，
Surgical wound infection=5，
Biliary tract infection=6
No=0，Yes=1
No=0，Yes=1
No=0，Yes=1
No=0，Yes=1
No=0，Yes=1
No=0，Yes=1
<1.31=0
≥1.31=1
<2.39=0
≥2.39=1
表42组不同临床特征患者28d死亡率对比[n,(%）]
Tab.4Comparison of28d mortality of patients with different clinical characteristics in group2[n,(%）]
Independent variable
Gender
陈子良BMI（kg/m2）
CRP（mg/L）Serum lactate（mmol/L）APACHEⅡscore（score）
VitD（ng/ml）Intervention of vasoactive drugs Mechanical ventilation assisted
ventilation Extracorporeal pulmonary mem‐
brane support Continuous blood purification
Glucocorticoid Primary infection site
Diabetes mellitus
Hypertension
Myocardial injury
Burn
Liver injury
2or more complications
miR-10a
miR-21
Conditions
Male
Femal
<18.5
18.5~24.9
>24.9
≥40
20~40
≥3
2~3
≥20
<20
>26
<26
Yes
No
Yes
No
Yes
No
Yes
No
Yes
No
Pulmonary infection
Urinary tract infection
Celiac infection
Infectionofcentralsystem
Blood infection
Surgical wound infection
Biliary tract infection
Yes
No
Yes
No
Yes
No
Yes
No
Yes
No
Yes
No
≥1.31
<1.31
≥2.39
<2.39
Death group
（n=29）
16（55.17）
13（44.83）
8（27.59）
9（31.03）
12（41.38）
21（72.41）
8（27.59）
18（62.07）
11（37.93）
25（86.21）
4（13.79）
12（41.38）
17（58.62）
9（31.03）
20（68.97）
11（37.93）
18（62.07）
6（20.69）
23（79.31）
12（41.38）
17（58.62）
5（17.24）
24（82.76）
6（20.69）
9（31.03）
1（3.45）
3（10.34）
6（20.69）
4（13.79）
2（6.90）
4（13.79）
25（86.21）
6（20.69）
23（79.31）
2（6.90）
27（93.10）
1（3.45）
28（96.55）
3（10.34）
26（89.66）
2（6.90）
27（93.10）
25（86.21）
4（13.79）
19（65.52）
10（34.48）
Survial group
（n=73）
39（53.42）
34（46.58）
26（35.62）
25（34.25）
22（30.14）
35（47.95）
38（52.05）
28（38.36）
45（61.64）
37（50.68）
36（49.32）
58（79.45）
15（20.55）
15（20.55）
58（79.45）
16（21.92）
57（78.08）
14（19.18）
59（80.82）
23（31.51）
50（68.49）
14（19.18）
59（80.82）
14（19.18）
17（23.29）
9（12.33）
6（8.22）
19（26.03）
1（1.37）
5（6.85）
11（15.07）
62（84.93）
18（24.66）
55（75.34）
8（10.96）
65（89.04）
3（4.11）
70（95.89）
7（9.59）
66（90.41）
5（6.85）
68（93.15）
25（34.25）
48（65.75）
10（13.70）
63（86.30）
c2
0.0261)
0.0961）
5.0191）
4.7131）
9.5472)
13.9731）
1.2681）
2.7341）
0.0301）
0.897
0.0032)
0.0301）
0.0212）
0.0281)
0.0642）
0.1682）
0.0642）
0.1812）
20.3922）
24.9011)
P
0.873
0.756
0.025
0.030
0.002
0.000
0.260
0.098
0.862
0.343
0.956
0.862
0.884
0.867
0.800
0.682
0.800
0.670
0.000
0.000
Note：1）c2test；2）Calibration c2test.
3讨论
miRNA在人体中的表达异常可引起某些疾病的发生和发展［11-12］。miRNA不仅与肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡有关，还参与异常的机体免疫应答和炎症反应过程［13］。脓毒症是由感染引起的全身性炎症反应，严重时患者器官发生衰竭，病情凶险，死亡率高，因此迫切需要生物标志物预测老年重症脓毒症患者28d病死率，协助判断预后。既往研究证明，miR-21与脓毒症的发病和进展相关，但是有关miR-10a在脓毒症患者中的表达研究鲜有，同时二者与老年重症脓毒症患者28d死亡率之间的关系尚未阐明，是否可以作为预测其预后的标志物，是一项值得探讨的课题［14］。
本研究发现，患者28d病死率为28.43%，入院时死亡组外周血miR-10a、miR-21表达水平显著高于存活组，说明外周血miR-10a、miR-21的高表达与老年重症脓毒症28d病死率有关，外周血miR-10a、
miR-21表达水平影响患者病情发展。霍锐等［9］研究发现，脓毒症所致肾损伤患者28d病死率为35.53%，本研究与之有一定差距，可能由于本研究所选研究对象高龄、发展到严重时期时已确诊为脓毒症的原因使其成为重点防护对象，更确切，从而病并且还发现死亡患者血清中miR-10a-5p表达水平升高，本研究与之一致，说明外周血中miR-10a水平对脓毒症患者28d病死率影响较大。WANG等［15］发现脓毒症患者体内miR-21表达升高，且经过体外细胞培养发现miR-21升高直接加重肾小球的滤过屏障功能的损伤，说明miR-21的高表达可能与脓毒症患者的病情有关。
本研究中经Logistic回归分析发现，外周血miR-10a表达水平≥1.31、外周血miR-21表达水平≥2.39、APACHEⅡ评分≥20分、CRP≥40mg/ml、血清乳酸≥3mmol/L是老年重症脓毒症患者28d病死的独立危险因素，VitD>26ng/ml是老年重症脓毒症28d病死的保护因素。研究报道［16］，APACHEⅡ评分是脓毒症患者28d死亡的独立危险因素，APACHEⅡ评分≥19.5分的脓毒症患者，28d病死率显著上升，说明病情越严重患者死亡风险越高，需在患者入院时及时进行APACHEⅡ评分，根据其是否存在高病死风险，及时采取有效干预措
表5Logistic回归分析
Tab.5Logistic regression analysis
Influencing factors
APACHEⅡscore
≥20vs<20
CRP
＞40mg/L vs20mg/L~40mg/L
Serum lactate
≥3mmol/L vs2mmol/L~3mmol/L
VitD
>26ng/ml vs<26ng/ml
miR-10a
≥1.31vs<1.31
miR-21
≥2.39vs<2.39
β
1.465
0.498
1.394
-1.136
1.765
0.687
SE
0.423
0.157
0.456
0.359
0.225
0.146
Waldχ2
11.995
10.061
9.345
10.013
61.535
22.142
P
0.000
0.001
0.002
0.001
0.000
0.000
OR
4.328
1.645
4.031
0.321
5.842
1.988
95%CI
4.256~4.538
1.546~1.856
3.759~
4.185
0.213~0.415
4.689~
5.945
1.879~
2.005
表6miR-10a、miR-21及联合对老年重症脓毒症患者28d死亡率的预测价值
Tab.6Predictive value of miR-10a，miR-21and their combination on28d mortality in elderly patients with severe sepsis
Indexes miR-10a miR-21 Combination Cut-off
1.68
1.81
-
Sensitivity（%）
93.10（27/29）
82.76（24/29）
82.76（24/29）
Specificity（%）
73.97（54/73）
84.93（62/73）
90.41（66/73）
AUC
0.863
0.893
0.920
95%CI
0.778~0.949
0.809~0.966
0.869~0.
978
图1miR-10a、miR-21及联合预测ROC曲线
Fig.1Curve of miR-10a，miR-21and combination pre⁃
diction ROC
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