生理学报,1999年8月,51(4),449～453 449 Acta Physiologica Sinica
猫皮层体感Ⅱ区内脏伤害感受神经元的
电生理特性及形态特征3
陈京红 刘素珍33 滕国玺33
(军事医学科学院药物毒物研究所，北京100850;
33中国医科大学脑研究所神经生理研究室，沈阳110001)
摘 要 应用胞内记录和标记技术，观察了猫皮质第Ⅱ感觉区(the second s omatosens ory cor2
明，在251个记录单位中，有109个为内脏伤害性感受神经元，其诱发反应分为兴奋性(占总
数的38153%)、抑制性(42120%)及混合性(19131%)三类。在形式上IPSP及EPSP2IPSP序列反
应较多。对其中21个神经元用神经生物素进行细胞内电泳标记，显示细胞的形态特点是胞体
较小，分布于皮质Ⅱ、Ⅲ及Ⅴ层，其中兴奋性神经元形态多为复杂的锥体神经元，抑制性神
经元多为星型细胞。实验证明，体感SⅡ区存在内脏伤害性感受神经元。
关键词：皮层体感Ⅱ区；伤害性感受神经元；细胞内记录；细胞内标记；内脏痛
学科分类号:Q42;R338
很多研究表明，大脑外侧裂的第Ⅱ感觉区(the second s omatosens ory cortex,SⅡ)在痛觉感受和调制方面比SⅠ区具有更重要的作用[1]，且SⅡ区以感受内脏痛功能为主，但尚缺乏电生理及形态研究的直接证据[2]。内脏大神经(greater splanchnic nerve,G S N)的C 纤维是上腹腔痛的主要传导途径，在SⅡ区中有其明确的代表区[3]。本工作用在体微电极细胞内记录技术，研究皮质SⅡ区中G S N代表区内脏伤害性感受神经元(visceral noci2 ceptive neurons,VNNs)的电生理特性，并对部分神经元用神经生物素(neurobiotin)进行标记，从机能和形态结合的角度为SⅡ区在内脏痛感受中的作用提供新的科学依据。
电生理记录 猫16只(210～312kg bw)，用钠(40mg/kg)静脉麻醉，腹膜外暴露G S N，在向心端置双极银丝刺激电极。暴露皮质SⅡ的G S N代表区(AP,1415～1610 mm;LR,1310～1410mm;H<315mm)[3]。小脑延髓池引流以降低脑压。维持肛温于37～38℃。
玻璃微电极尖端直径≤015μm，内充3m ol/L K Cl溶液，标记时内充神经生物素(Sig2 ma公司)的醋酸钾
溶液。于SⅡ中G S N代表区，选RP绝对值>40mV、电极停留5min以上放电形式稳定的神经元进行观察。将引导的细胞内电位经MEZ28201生物放大器输入VC210示波器，观察神经元的电活动，同时作磁带记录。用AT AC2350机处理数据，并由X2Y记录仪描记实验结果。刺激G S N的参数为波宽015～110ms、强度016～110mA的单矩形方波恒定电流，此强度足以使该神经中Aδ和C纤维兴奋，并产生瞳孔变化，刺激反应可被抑制。
1998207204收稿 1998210212修回
3国家自然科学基金资助项目(N o139170294)
形态学观察 电生理实验后，部分神经元以强度1～3nA 、波宽为220ms 、频率1H z 持续3～15min 的正电流进行神经生物素电泳，然后灌流动物，取脑块于固定液中放置过夜，翌日做冠状连续切片(50～70μm )。将切片经带有HRP 的avidin 处理后,P BS 冲洗,DAB 呈反应，光镜检查分析，部分刺激相关神经元用中性红染进行组织学定位。用绘图管对连续切片进行三维重建工作，图像分析仪测定胞体大小及形态学的有关数据。
本文将S Ⅱ区神经元的电生理及形态特点与我室曾测得的S Ⅰ区神经元相比较，采用组间对照，数据用t 检验及χ2检验法统计处理，定义P <0105为显著性界值。
实验在S Ⅱ区的G S N 代表区域共记录251个神经元。静息电位平均值为-54132±11158mV 。根据神经元对强刺激G S N 是否发生反应，分为内脏伤害感受神经元和内脏非伤害感受神经元(NVNNs )，其数量分别为109个(43143%)和142个(56157%)。
实验结果如下:
11 S Ⅱ区VNN s 的电生理特性
皮质S Ⅱ中G S N 代表区VNNs 的自发电活动形式呈多样性，但主要有突触活动、偶发性放电、高频持续性及节律性放电等模式。根据G S N 刺激强度不同,VNNs 产生不同的反应，测定出内脏痛伤害性反应阈值为016mA ，本研究均采用110mA ，即相当于阈值115倍的恒定电流刺激G S N ，作为内脏痛伤害性刺激。
VNNs 的诱发反应主要分为兴奋性(42/109,38153%)、抑制性(46/109,42120%)及混合性(21/109,19130%)三类。将该区各类诱发反应所占比例与我们先前测得的S Ⅰ区的反应比例(兴奋性,203/412；抑制性,129/412及混合性,80/412)[9]进行方差分析，有显著性差异(P <0101)。对于自发放电活动为突触活动或偶发性放电形式的VNNs ，阈上刺激出现潜伏期固定的诱发反应。而对于高频自发放电的神经元，其诱发反应与自发放电整合后出现诱发锋电位、增频、高频抑制及放电模式转换等现象。
诱发反应有兴奋性突触后电位(EPSP )和抑制性突触后电位(IPSP )，以IPSP 的出现率较高(占总数的67%)。短潜伏期成分的潜伏期为30146±7129ms (n =57)，第二成分潜伏期为73179±8183ms (n =87)，第三成分为213±13182ms (n =26)
。
图1 S Ⅱ区不同VNNs 对刺激G S N 诱发的各种兴奋性和抑制性反应
Fig 11 Excitatory and inhibitory responses of a variety of VNNs ev oked by stimu 2
lating G S N in S Ⅱarea
A :poly 2EPSPs ;
B :spikes on EPSP ;
C :uni 2IPSP ;
D :mixed response.
054生 理 学 报 51卷
G S N诱发的兴奋性反应包括刺激诱发的EPSP及叠加其上的锋电位发放、诱发锋电位或增频反应。抑制性反应包括IPSP和锋电位抑制或减频反应(图1)。混合性反应包括EPSP2IPSP 序列反应神经元13个，短暂放电抑制后增频的神经元4个及先增频后抑制的神经元2个。 实验观察了对G S N诱发的SⅡ区VNNs反应的影响。对于潜伏期和反应形式都较稳定的7个神经元，静脉注射1mg/kg,2min后长潜伏期放电消失,3例抑制性反应神经元的放电却有所增加,20min后部分神经元可以恢复反应，此间刺激G S N，瞳孔变化不明显。此结果说明可抑制VNNs的反应。
2. SⅡ区VNN s的形态学特点
本实验共标记成功21个SⅡ区VNNs，分布于第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ层(见表1)。其胞体直径一般在10～40μm范围内，胞体平均直径为16128±2195μm(n=21)。其中, 6119%神经元为锥体细胞,3811%神经元为星型细胞。标记细胞在第Ⅲ层最多，占4716%。5个抑制性反应神经元均为星形细胞，兴奋性及混合性反应细胞兼有锥体及星型细胞，但兴奋性神经元多为锥体细胞。
图2为一兴奋性VNNs的三维重建图。许多锥体神经元的树突上有大量树突棘,
表1 SⅡ区VNNs的分布及形态特征T able1 Distribution and m orphologic prop2 erties of VNNs in different layers of
SⅡarea
Layer
Pyramidal
cells
S tellate
cells
T otal
Ⅱ415
Ⅲ8210
Ⅳ22
Ⅴ134
T otal138
21
图 2 在皮质体感二区神经生物素标记的VNNs三维重建图
Fig12Reconstruction of the VNNs labelled by neurobiotin
in SⅡarea
×256,ABC staining method.
顶树突伸向皮质表面，上升过程中
分为树突树。轴突多从胞体底部
发出，沿途多有侧支发出。增频反
应神经元的轴突侧支多有念珠状
的膨体存在，这些侧支分布在胞
体所在及邻近层次。星形细胞多
为无棘树突，并呈辐射形状发出
(图2)。标记的VNNs的主要形态
及所在细胞层次见表1。此外，在
该区的单细胞标记中，出现多次多
细胞同时被染的现象。
皮质SⅡ的G S N代表区中
VNNs诱发反应的特点：关于皮质
SⅡ区神经元的功能特性研究的资
料十分有限[4,5]，细胞内记录的
VNNs的电生理反应及形态特征的
研究尚未见报道。本实验在SⅡ区
的G S N代表区记录了109个VNNs
的细胞内电生理反应，并观察了
154
4期 陈京红等：猫皮层体感Ⅱ区内脏伤害感受神经元的电生理特性及形态特征
254生 理 学 报 51卷
21个VNNs的形态特点，这些神经元分布在皮层的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ层，此结果从机能和形态两方面充分证明皮质SⅡ区存在VNNs。
根据本实验室在SⅡ后肢代表区的研究工作[2]，我们认为本实验观察到潜伏期30ms 左右VNNs诱发反应成分为Aβ纤维传入成分，潜伏期70ms左右的成分为Aδ纤维传入引起，而大于140ms的反应为C纤维传入所致，后两者可作为内脏痛研究的适宜指标。这些反应的高阈值性、潜伏期长、反应可被等药物所抑制及刺激同时观察到散瞳现象等特点，说明此类诱发反应具内脏伤害感受性质。
实验观察到抑制性VNNs的比例明显高于SⅠ区。据我们在SⅠ[12]及SⅡ区神经元的形态学实验结果，抑制性VNNs主要是星形细胞的中间神经元，说明SⅡ区存在更多的中间神经元，从而构成更复杂的神经环
路，以介导更复杂、更高级的感受功能[6]。由此可设想，内脏诱发反应的这种复杂性也许与皮层SⅡ区参与内脏痛的情绪感受有关，有待进一步证实。
从SⅡ区VNNs的形态特点看，其胞体明显小于SⅠ区VNNs的胞体均径(21171±10105μm,n=24,P<0101)，细胞密度大且分层不如前者明显。VNNs中锥体神经元的树突上存在大量树突棘，以接纳由多突触传入的内脏伤害性信息。含有膨体的轴突侧支密布在胞体周围层次，说明兴奋性反应神经元可形成自身突触，构成局部微环路，增强兴奋调节机能。星形细胞多为无棘树突，呈辐射形状发出。而且在SⅡ区VNNs的单细胞标记中，更容易出现素耦联现象，也说明SⅡ区VNNs间可能由更多的缝隙连接相联系，从而组成交互环路，使相关神经元的活动呈现同步化[7]，以介导复杂的痛觉反应活动。
长期以来，人们对大脑皮质是否参与内脏痛的感受和调制颇有争议。Lende[8]报道，切除SⅡ区，有助于顽固性痛的缓解。有人推测,SⅡ区与痛觉的认知关系不大，而与警觉、情绪机制有关[2,8]。PET法测得，疼痛刺激受试者SⅠ、SⅡ区、腹侧脑岛和前扣带回的活动均增强[1]。SⅡ区与许多痛调制的关键核团有密切的纤维联系，此为SⅡ区参与痛调制的解剖学基础。由于内脏痛具有较为复杂的情绪变化之特点,SⅡ区又有其明确的代表区，因而通常认为其与内脏痛的感受关系更为密切。所以我们推测，内脏伤害性信息经多突触传递投射到皮质SⅡ区，进行整合后产生痛感，可能再向岛叶投射[10]，间接达到ACC等边缘系结构[11]，参与形成与内脏痛有关的情绪反应，但确切的传导机制还有待于进一步研究。
参 考 文 献
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Acta Physiologica Sinica
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E L ECTROPH YSIOLOGICAL AN D MORPH OLOGICAL
CHARACTERISTICS OF THE VISCERAL NOCICEPTIVE
NEURONS IN CORTEX S ⅡAREA OF CATS 3
CHE N J I NG
2H ONG, LI U S U 2Z HE NG, TE NG G UO 2X I (Institute o f Pharmacology and Toxinology ,Academy o f Military Medical Sciences ,Beijing 100850;33Laboratory o f Neurophysiology ,Brain Research Institute ,China Medical Univer sity ,Shenyang 110001)
ABSTRACT
Electrophysiological and m orphological properties of the visceral nociceptive neurons (VNNs )in the
secondary s omatosens ory cortex (S Ⅱ)area of 16cats were investigated with intracellular recording and labeling method.Electrophysiological properties of a total of 251neurons were identified ,109of which were induced to discharge by stimulating the greater splanchnic nerve and therefore were sim ply designated as VNNs.Various patterns of the response could be recorded :excitatory (38153%),inhibitory (42120%)and ex 2citato 2inhibitory (19131%).F ollowing acquisition of electrophysiological data ,neurobi 2otin was injected into 21cells by electrophoresis to show their m orphology and distribution in the cerebral cortex.It was found that excitatory VNNs were pyramidal neurons predom 2inantly ,whereas m ore inhibitory VNNs were stellate neurons.
K ey w ords :second s omatosens ory cortex ;visceral nociceptive neuron ;intracellular recording ;intra 2
cellular labeling ;visceral pain
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544期 陈京红等：猫皮层体感Ⅱ区内脏伤害感受神经元的电生理特性及形态特征
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