文章编号：1001-8689(2020)11-1097-06
杜营彬 王娅* 刘佩 李坤洋 邓俊良 左之才 才冬杰 任志华 苟丽萍
(四川农业大学动物医学院，成都 611130)
摘要：SOS 应答是普遍存在于细菌中的一种低保真度的DNA 修复方式。当细菌DNA 受损时，大量的DNA 单链堆积，SOS 应答启动并诱导远距离基因表达参与DNA 修复。此修复过程缺失了DNA 复制的校正功能，因此SOS 应答会大大增加细菌的基因突变频率从而使细菌能够更快的适应不利环境。另一方面，随着细菌耐药的日益严峻，qnr 基因家族成为质粒介导的喹诺酮耐药(plasmid-mediated quinolone resistanc PMQR)研究热点。有报道发现细菌的SOS 应答会对菌株的qnr 耐药水平造成明显的差异性，完整的SOS 应答能够使菌株MIC 成倍增加。由此可以怀疑SOS 应答对qnr 基因的表达存在相应的调控机制，但是相关机制尚未阐明。基于此本文就SOS 应答机制和qnr 耐药机制二者之间的关系进行试探性的综述。
关键词：SOS 应答；qnr 基因；调控机制；细菌耐药中图分类号：R978 文献标志码：A
Progress in the regulation of SOS response on plasmid-mediated
qnr resistance gene expression
Du Ying-bin, Wang Ya, Liu Pei, Li Kun-yang, Deng Jun-liang, Zuo Zhi-cai,
Cai Dong-jie, Ren Zhi-hua and Gou Li-ping
(College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130)
Abstrct SOS response is a low fidelity DNA repair method commonly found in bacteria. When bacterial DNA is damaged, a large number of single strands of DNA accumulate and SOS response initiates and induces long-distance gene expression to participate in DNA repair. This repair process lacks the correction function of DNA replication, and thus the SOS response can greatly increase the frequency of gene mutation in bacteria so that bacteria can adapt to adverse environment faster. On the other hand, the qnr gene family has become a hotspot of plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) research with the increasingly serious situation of bacterial resistance. It has been reported that the bacterial SOS response can cause significant difference in qnr resistance level of the strain, and the complete SOS response can increase the MIC of the strain by several folds. It may be suspected that SOS response regulates qnr gene expression, but there is no report on the mechanism of SOS response regulating qnr resistance in bacteria. Based on this, the relationship be
tween SOS response mechanism and qnr resistance mechanism was tentatively reviewed.
Key words SOS response; qnr gene; Regulatory mechanism; Bacterial resistance
收稿日期：2019-10-24
作者简介：杜营彬，男，生于1997年，在读硕士研究生，研究方向：中西结合与临床，E-mail:****************
*
通讯作者，E-mail:******************
喹诺酮类(4-quinolones)抗菌药是一种人工合成类药物[1]。萘啶酸(nalidixic acid)作为第一代喹诺酮
抗菌药能对革兰阴性菌发挥良好的作用，而氟喹诺酮是在此基础之上有更广的抗菌作用的新一代喹诺
综 述
酮药物(如氧氟沙星，环丙沙星等)[2]。随着喹诺酮类抗菌药的大量使用，细菌的耐药现象也日益严峻[3]。质粒介导的喹诺酮耐药(plasmid-mediated quinolone resistanc，PMQR)也被证实为细菌喹诺酮耐
药的主要方式[4-5]。已经被发现的PMQR基因主要有qnr家族、aac(6')-lb-cr和qepA，其中qnr家族最为复杂，主要以多种不同类型的Qnr蛋白和突变体普遍存在于各种细菌之中[6-7]。
SOS应答(SOS response)现象最早在噬菌体中发现，Weigle[8]发现被紫外线照射过的噬菌体能够通过感染被紫外线照射过的细菌而继续生存下去。Radman在1974年研究解释这是一种细菌自身的一种修复系统：细菌细胞内普遍存在着许多被抑制表达的基因，正常情况下这些基因的表达被抑制，而当细菌处于不利环境时，被抑制的基因诱导表达修复不利环境对细菌造成的损伤，但同时大大提高了其基因突变的频率。因此修复系统为细菌受损时的紧急修复系统，被Radman命名为“SOS repair”[9]。SOS应答系统普遍存在于大肠埃希菌、沙门菌等多种致病菌中，对不利环境下细菌的存活与进化有着至关重要的意义[10]。
SOS应答和质粒介导的qnr耐药作为细菌受损或处于不利环境时的保护或修复机制，当细菌在受到喹诺酮的威胁时SOS应答和qnr基因有着共同的目的——使细菌存活，那么二者之间是否存在着相互调控的关系？基于此本文就SOS应答机制和qnr耐药机制二者之间的关系进行试探性的综述。
1 质粒介导的喹诺酮耐药基因
1.1qnr
qnr是指能够编码五肽重复序列蛋白的基因，其编码的Qnr蛋白能够使相应的菌株形成对喹诺酮一定的耐药性[11]。qnr基因可以按照氨基酸或核苷酸序列达到30%以上的差异分为不同种类[12]。
PMQR在1998年首次由Martinez和同事在研究pMG252(源于阿拉巴马大学患者尿液样品)质粒时，从一株多重耐药的肺炎克伯雷菌(Klebsiella pneumoniae)检测并报道[11]。将pMG252质粒接合于大肠埃希菌J53后，其对萘啶酸的MIC由4mg/L增加到32mg/L，环丙沙星MIC值由0.008mg/L增加到0.25mg/L[11]。最终将该基因命名为qnrA，大小为657bp，编码产物为QnrA 蛋白[13]；qnrB是2004年由Jacoby从bla
CTX-M-15
(源于印度南部1株肺炎克雷伯菌株)质粒中首次发现[12]，拥有该基因的菌株表现出对喹诺酮类药物的低水平抗性，但使用PCR无法扩增出qnrA基因，该基因被证明为新的耐药基因qnrB，与qnrA的同源性为39.5%[13]。高浓度的QnrB可以在DNA回旋酶近4000倍浓度时保护效应约为低浓度时的5倍左右[14]；qnrS基因发现于日本爱知县志贺菌疫病患者体内分离出的志贺菌，经研究后从分离株中携带的可转移质粒中克隆出一个全新的喹诺酮耐药基因。且该基因的编码蛋白氨基酸序列与QnrA蛋白的同源性高达59%，被命名为qnrS[15]。
1.2aac(6')-Ib-c基因和qepA基因
aac(6')-Ib是一种氨基糖苷乙酰基团转移酶，其变异基因aac(6')-Ib-c可同时作用于氨基糖苷类和氟喹诺酮类两类结构不同的抗菌药物，并引起了较高水平的耐药性[16]。Vetting等[17]把二者的突变体基因序列进行比较后发现其序列相似性达到98.8%，表明aac(6')-Ib-c也是其一个突变体，编码有172个氨基酸的蛋白质AAC(6')-Ib-c。喹诺酮类药物特异性外排泵编码QepA蛋白由1536bp核苷酸组成[18]。有研究表明含有qepA基因的大肠埃希菌细胞内诺氟沙星的浓度比不含该基因浓度显著降低，但加入外排泵抑制剂后，细胞内的诺氟沙星又重新恢复高浓度水平，故而证明QepA具有外排泵作用，可将细菌体内的药物泵出使细菌表现为耐药[18]。
1.3 Qnr蛋白作用机制
Qnr蛋白能够为细菌提供低水平的耐药，保护细菌的DNA促旋酶和拓扑异构酶IV不受喹诺酮类药物的抑制[19]。有研究发现SOS应答能够直接上调Qnr蛋白的表达，上调表达的Qnr蛋白能够直接结合于DNA促旋酶位点附近，进而降低喹诺酮药物的结合能力[20]。在对Qnr蛋白体外研究中发现，该蛋白可以保护大肠埃希菌的DNA促旋酶并使环丙沙星的最小抑菌浓度上升，其保护效应与蛋白浓度成正比关系[21]。在促旋酶与DNA结合时，Qnr就会特异性结合在促旋酶及GyrA和GyrB上，但是Qnr和DNA在促旋酶上的结合位点不同，而当促旋酶与Qnr结合时则会降低促旋酶与DNA的结合能力。Qnr蛋白就通过减低药物-促旋酶-DNA 3者复合体的浓度减弱喹诺酮药物的抑菌能力，产生耐药[19,22]。
2 SOS应答系统
SOS应答是一种普遍存在于细菌体内的DNA紧急修复机制。单链DNA(ssDNA)是SOS应答的启动信
号，喹诺酮类抗菌药通过结合于细菌的拓扑异构酶和DNA 促旋酶来抑制细菌的DNA 复制，在细菌体内造成大量的DNA 单链堆积从而诱导SOS 应答系统的启动[23]。除此之外，如高压、紫外线、营养状态都可以影响SOS 应答系统的启动[24-26]。2.1 SOS 应答的一般途径
在SOS 应答中有两个基因起着调控作用，即recA 和lexA 。细菌体内存在着两种SOS 应答启动途径：一种是依赖于recA-lexA 调控因子的方式，另一种则是不需要依赖于recA-lexA 的途径[27]。
正常细菌细胞中，LexA 组成二聚体与SOS 应答基因启动子区域的SOS box 结合，SOS box 为一段保守性回文序列TACTG(TA)5CAGTA [28]。因为SOS box 所存在的位置也是RNA 聚合酶的结合(邻近)位点，当LexA 二聚体与SOS box 结合时便阻碍了RNA 聚合酶与SOS 基因的结合从而抑制SOS 应答[23]。然而当细菌受损时(大量抗菌药物所带来的不利环境)，单链DNA 就会在细胞内积累，当单链DNA 积累到一定程度时便会与SOS 应答中的另一种调节因子RecA 结合成一种核酸蛋白复合物(RecA filament)，随后介导LexA 二聚体在Ala 94-Gly 85位点上的裂解从SOS box 脱落，SOS 应答基因获得表达(图1)。2.2 SOS 应答主要基因及其表达产物
SOS 应答的主要调控子包括有umuD 、C 、recA 、lexA 和dinB 等。其中recA 重组修复基因；核苷酸切除修复基因uvrAB 、uvrD ；易出错的DNA 聚合酶基因
dinB 和umuDC (分别编码DNA 聚合酶IV 、II)均由lexA 调控子调控[28]。这种低保真度、易出错的修复DNA 聚合酶允许DNA 跨永久性损伤进行复制，但同时也会促进突变率的提高，从而产生遗传多样性和适应性，包括抗菌药耐药的进化。
2.2.1 lexA 基因
lexA 基因编码202个氨基酸构成LexA 蛋白在细胞体内发挥作用，大小约为22.3kd 。LexA 蛋白拥有N 端与DNA 结合和C 端催化中心两个结构域，且二者之间通过5个氨基酸残基结合而成的高度灵活的铰链区连接[29]。正常条件下，LexA 蛋白以二聚体的形式通过N 端的带翅翼的特殊结构(螺旋-转角-螺旋)与SOS box(SOS 基因的启动子且能够被LexA 蛋白识别的区域)结合存在于细胞内。在非诱导的情况下，细菌细胞体内约为2μm ol/L ，除了结合于SOS box 上的二聚体之外，只有约20%的LexA 蛋白处于游离状态[19]。LexA 蛋白能够在细胞体内持续表达，当ssDNA 诱导信号消失完成DNA 修复之后，LexA 蛋白就能迅速重新结合在SOS box 上达到抑制SOS 基因表达的效果[30]。2.2.2 recA 基因
recA 基因编码352个氨基酸构成RecA 蛋白在细胞体内发挥作用，大小约为38kD [31]。RecA 蛋白在非诱导情况下能够在细胞内表达较高水平，且能够保证细胞同源重组的正常进行。在诱导细胞中，RecA 蛋白能够迅速与ssDNA 结合成为RecA-ssDNA-ATP 三维复合物；当细胞损伤加重，RecA-ssDNA-ATP 三维复
图1 SOS 应答过程示意图 Fig. 1 SOS response process diagram
SOS box
SOS box
SOS genes
SOS genes
LexA 二聚体
RNA 聚合酶
RNA 聚合酶
LexA 解离
RecA-ssDNA 复合物
DSBs 单链DNA
RecA
DNA 损伤
DNA 双链
合物在细胞内积累使LexA蛋白从SOS box解离降解，从而使RNA聚合酶能够正常结合于SOS基因的启动子，使SOS应答基因(包括lexA与recA)大量表达[32]。
2.2.3umuD和dinB基因
在细胞体内一共有5种DNA聚合酶，当SOS应答启动时，umuD和dinB基因的表达产物Pol V和Pol IV 就会增加，且这两种DNA聚合酶都在基因突变中发挥了非常重要的作用[33]。在大肠埃希菌中，umuD所编码的DNA聚合酶V并不具有5'→3'端外切活性，也不具有3'→5'端外切活性，因此该聚合酶并不具有较严谨的校正功能，大大提高了基因突变的几率[34]。而dinB所编码的DNA聚合酶IV与体内的突变体的活性直接相关，且这种DNA聚合酶缺少39至59个外切酶活性，在体内具有分布性拉长失调引物/模板的倾向[35]。这些特性明显的促进了dinB编码的DNA聚合酶在体内的诱变特性。
3 SOS应答的对Qnr蛋白的调节机制
SOS应答能够促进细菌细胞基因突变的频率以应对抗生素的不利环境，增加细菌的生存率。通过体内和体外试验发现，环丙沙星可以将细菌的耐药性大大提高，且在SOS应答的情况下可以将细菌耐药的突变频率增加1万倍[21]。在环丙沙星和莫西沙星的诱导下，qnrA的表达量明显升高。表明这菌株对环丙沙星表现出不同的MIC值与qnrA的表达水平密切相关[36-37]。研究表明qnrB基因在SOS调控之下，且qnrB的诱导表达需要完整的SOS系统。
3.1qnr的启动子特征
Frhman利用5'端快速扩增qnrB2的cDNA确定了qnrB2的启动子序列，其转录起始位点(+1)是定位于起始密码子上游-28位[38]。且有相关研究通过鉴定了qnrB2的转录起始位点与起始密码子之间的CTGTATAAAAAAACAG序列与伽马变形菌具有同源性，提示了qnrB2可能受lexA调控[39]。
3.2lexA对qnr的调控
为了探究qnrB2的表达是否依赖于lexA调控，Sandra等[40]通过构建了一个携带有lacZ表达基因和qnrB2基因的重组质粒(ppqnrB2)，并将构建后的ppqnrB2-lac分别导入5株大肠埃希菌K12 MG1656、MG1655的Lac衍生物、K12 DM49菌株、MG1656 D lexA菌株(缺失lexA)和MG1656 D recA菌株(缺失recA)[41]。最后对测定β-半乳糖苷酶活性得出，MG1656、MG1655的Lac衍生物和MG1656 D recA 3个菌株的表达量基本处于同一水平，分别约为K12 DM49菌株的6倍和MG1656 D lexA菌株的5倍。为
进一步证实SOS反应参与qnrB2调节，该研究还测定了经丝裂霉素C(SOS应答体外激活剂)和环丙沙星处理的MG1656 β-半乳糖苷酶，结果发现无论是丝裂霉素C还是环丙沙星处理都会使MG1656(ppqnrB2-lacZ)培养物中的β-半乳糖苷酶活性增加近一倍，而在MG1656 D lexA中没有发生相似的变化，表明丝裂霉素C和环丙沙星对ppqnrB2表达量的调节是依赖于lexA完成的；且该两种药物皆对其他几种接合质粒的大肠埃希菌无诱导作用[42-43]。
3.3recA对qnr的调控
SOS应答的启动受到recA所编码的RecA蛋白的调控，王进文[44]以通过敲除SOS应答的启动蛋白基因recA构建SOS应答被抑制的菌株模型为对照，研究在恩诺沙星压力下，recA基因缺失的药物敏感性和抗药性变化。在梯度平板连续设置药物浓度测定MIC的试验中，使用恩诺沙星处理过的正常菌株形成的抗药性菌落比不处理的菌落显著增加；而recA 基因缺失的对照菌株处理前后所形成的菌落数菌明显少于野生菌株，说明recA基因缺失后，菌株不易产生耐药性。在荧光定量PCR测定E. coli ATCC25922中recA和umuC表达量时发现，在恩诺沙星压力下，recA表达量上调至显著高于本底水平，且qnrB表达量也随之上升，表明在此条件下大肠埃希菌中SOS 应答系统启动。不仅如此，在关于recA对SOS应答基因的调控中发现recA缺失的对照菌株能够有效的抑制umuC表达量的升高[44-45]。
SOS应答是大肠埃希菌中一个重要的全局性调控系统，受R e c A-L e x A蛋白的双向调节，调控40~60
个重要基因，约占大肠埃希菌总基因的0.93%~1.58%[46]。qnr基因位于SOS启动位点的下游，因此也受到了recA基因的调控，使细菌呈现出抗药性表型；通过对recA基因敲除后，显著改善了基因缺失菌株对恩诺沙星的耐药性，使其对恩诺沙星的变异率降低。因此可以证明qnr的表达可由SOS 应答通过依赖于recA-lexA方式调节。
4 小结与展望
喹诺酮类药物通过作用于细菌DNA促旋酶和拓扑异构酶IV发挥作用，破坏其DNA双链结构造成大量的ssDNA堆积进而为SOS基因的表达提供基础条件。SOS应答作为存在于细胞体内的紧急DNA紧急
修复系统，虽然能够快速修复DNA，但是却失去了DNA复制中的高保真度。SOS应答的调节因子lexA 和recA保证了在正常情况下的低表达机制，qnr基因位于SOS启动基因recA下游附近，因此在正常情况下qnr基因受LexA蛋白结合于SOS box的原因处于低表达的程度，细菌表现出低水平的耐药。当喹诺酮类药物进入细菌体内抑制其DNA复制时，产生大量的ssDNA作为启动因子与RecA结合，作用于LexA二聚体使其解离并降解，SOS基因进一步表达，Qnr蛋白也被大量表达并结合于DNA促旋酶和拓扑异构酶进行保护，因此呈现出SOS介导qnr基因大量表达而使细菌表现为高水平的耐药。
尽管基因调控网络非常复杂，但SOS应答对病原菌抗药性表现出显著的调控作用，在施药动物体内生存的病原菌会运用多种抗药性机制抵抗抗菌药杀灭作用和宿主免疫作用，给临床和新型抗菌药物
研发都带来了巨大的困难。只有综合和扩展传统药理学、微生物学的经典方法，建立基于体内环境且兼顾抗药性与毒力的研究平台，才有可能进一步阐明病原菌SOS应答的调控机制，准确评价和提高抗菌药的疗效。
cr, and qepA among ceftiofur-resistant Enterobacteriaceae isolates from companion and food-producing animals[J].
Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(2): 519-524. [8] Weigle J J. Induction of mutations in a bacterial virus[J]. P
Natl Acad Sci USA, 1953, 39(7): 628.
[9] Radman M. SOS repair hypothesis: phenomenology
of an inducible DNA repair which is accompanied by mutagenesis[M]//Molecular mechanisms for repair of DNA.
Springer, 1975: 355-367.
[10] Da Re S, Garnier F, Guérin E, et al. The SOS response
promotes qnrB quinolone‐resistance determinant expression[J]. EMBO reports, 2009, 10(8): 929-933. [11] Martínez-Martínez L, Pascual A, Jacoby G A. Quinolone
resistance from a transferable plasmid[J]. The Lancet, 1998, 351(9105): 797-799.
[12] J a c o b y G,C a t t o i r V,H o o p e r D,e t a l.G U E S T
COMMENTARY[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008: 2297-2299.
[13] Tran J H, Jacoby G A. Mechanism of plasmid-mediated
quinolone resistance[J]. P Natl Acad Sci USA, 2002, 99(8): 5638-5642.
[14] Jacoby G A, Walsh K E, Mills D M, et al. qnrB, another
plasmid-mediated gene for quinolone resistance[J].
Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(4): 1178-1182. [15] Hata M, Suzuki M, Matsumoto M, et al. Cloning of a novel
gene for quinolone resistance from a transferable plasmid in Shigella flexneri 2b[J]. Antimicrob Agent
s Ch emother, 2005, 49(2): 801-803.
[16] Robicsek A, Strahilevitz J, Jacoby G A, et al. Fluoroquino-阿拉巴马大学
lone-modifying enzyme: A new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase[J]. Nat Med, 2006, 12(1): 83-88.
[17] Vetting M W, Park C H, Hegde S S, et al. Mechanistic and
structural analysis of aminoglycoside N-acetyltransferase AAC (6')-Ib and its bifunctional, fluoroquinolone-active AAC (6')-Ib-cr variant[J]. Biochemistry, 2008, 47(37): 9825-9835.
[18] Yamane K, Wachino J I, Suzuki S, et al. New plasmid-
mediated fluoroquinolone efflux pump, QepA, found in an Escherichia coli clinical isolate[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(9): 3354-3360.
[19] Tran J H, Jacoby G A, Hooper D C. Interaction of the
plasmid-encoded quinolone resistance protein Qnr with Escherichia coli DNA gyrase[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(1): 118-125.
[20] Wang M, Jacoby G A, Mills D M, et al. SOS regulation of
qnrB expression[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(2): 821-823.
[21] Cirz R T, Romesberg F E. Induction and inhibition
参考文献
[1] Andriole V T. The quinolones: past, present, and future[J].
Clin Infect Dis, 2005, 41(Supplement_2): S113-S119. [2] Ball P. Quinolone generations: natural history or natural
selection?[J]. J Antimicrob Chemother, 2000, 46(Suppl T1): 17-24.
[3] Ling T K, Xiong J, Yu Y, et al. Multicenter antimicrobial
susceptibility survey of gram-negative bacteria isolated from patients with community-acquired infections in the People's Republic of China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(1): 374-378.
[4] Colodner R, Keness Y, Chazan B, et al. Antimicrobial
susceptibility of community-acquired uropathogens in northern Israel[J]. Int J Antimicrob Agents, 2001, 18(2): 189-192.
[5] Robicsek A, Jacoby G A, Hooper D C. The worldwide
emergence of plasmid-mediated quinolone resistance[J].
Lancet Infect Dis, 2006, 6(10): 629-640.
[6] Strahilevitz J, Jacoby G A, Hooper D C, et al. Plasmid-
mediated quinolone resistance: a multifaceted threat[J]. Lin Microbiol Rev, 2009, 22(4): 664-689.
[7] Ma J, Zeng Z, Chen Z, et al. High prevalence of plasmid-
mediated quinolone resistance determinants qnr, aac (6')-Ib-
发布评论